肉牛源產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測

陳亮，劉雪松，馮萬宇，張蕾，沈思思，蘭世捷，李丹，苗艷

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

0 引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）屬于腸桿菌科[1]，可以引起多種疾病，包括肺炎、膀胱炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等[2]。隨著抗生素的使用，細(xì)菌的耐藥性問題逐漸暴露出來并且呈現(xiàn)出愈演愈烈的情況。第3代甚至第4代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素被廣泛應(yīng)用在治療革蘭氏陰性菌的感染中。但是隨著這些藥物的使用，陰性桿菌的耐藥性問題迅速增強(qiáng)。多種機(jī)制可引其革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性，其中包括了編碼PBPs的基因突變、主動(dòng)外排泵作用、細(xì)胞膜通透性的改變及產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶[3]。其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrum β-Lactamase）是導(dǎo)致陰性腸桿菌產(chǎn)生耐藥性最為常見的機(jī)制之一[4]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是由基因突變而產(chǎn)生的的一種酶，可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，讓藥物失去活性。根據(jù)編碼基因的不同，可將超廣譜β-內(nèi)酰胺酶分為TEM、CTX-M、SHV以及OXA等分型，其中TEM、CTX-M、SHV是常見的分型。CTX-M耐藥基因存在多種亞型。

2021年10月從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場分離出一株致病性肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的耐藥性，對(duì)其攜帶的耐藥基因進(jìn)行探究，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

致病性肺炎克雷伯君分離于黑龍江省齊齊哈爾周邊肉牛場。

1.1.2 試劑與儀器

腦心浸出液培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。Taq Master Mix以及DNA Marker，購自大連Takara公司。Bio-Rad梯度PCR儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明雌鼠6只，6周齡，體重大致在30～36 g，購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌純化

將臨床分離到的肺炎克雷伯菌劃線接種到BHI瓊脂培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線3代，將細(xì)菌進(jìn)行純化。

1.2.2 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

將純化后的細(xì)菌用BHI營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)到1.5×108CFU/mL后，試驗(yàn)組3只小鼠腹腔注射0.2 mL。對(duì)照組3只注射無菌生理鹽水。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)CLSI的指導(dǎo)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將細(xì)菌菌液培養(yǎng)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，將菌液均勻涂抹于MH瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻放置在平板上，2個(gè)藥敏紙片間距不低于24 mm，一個(gè)平板上最多放置5個(gè)藥敏紙片。

1.2.4 耐藥基因檢測

用DNA提取試劑盒提取DNA模板，進(jìn)行耐藥基因PCR檢驗(yàn)?？傮w積為25 μL，其中模板2 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

2 結(jié)果

2.1 致病性試驗(yàn)

將分離得到的細(xì)菌經(jīng)過純培養(yǎng)后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。試驗(yàn)小鼠在4 h內(nèi)全部死亡，經(jīng)過剖檢發(fā)現(xiàn)死亡小鼠的脾臟、肝臟有出血點(diǎn)。將死亡小鼠進(jìn)行心血涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)與克雷伯菌形態(tài)一致，該株細(xì)菌有致病性。

2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)看出該株致病性肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物皆產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)氟喹諾酮類處于敏感狀態(tài)。

2.3 耐藥基因

耐藥基因結(jié)果如圖1所示，通過PCR發(fā)現(xiàn)該株菌株含有CTX-M-2基因，為攜帶CTX-M-2耐藥基因的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌。

圖1 耐藥基因PCR鑒定結(jié)果

3 討論

克雷伯菌屬為革蘭氏陰性桿菌，其主要包含肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬結(jié)克雷伯菌等。其中肺炎克雷伯菌的致病性較強(qiáng)，在多種動(dòng)物中都曾分離出肺炎克雷伯菌。從陜西某規(guī)?；i場中分理處一株具有致病性的肺炎克雷伯菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)以及耐藥基因的檢測。從內(nèi)蒙古通遼某羊場病死羊中分離出了一株致病性肺炎克雷伯菌，并對(duì)其攜帶的毒力基因進(jìn)行了探究。從遼寧某小白鵝廠中分離出一株肺炎克雷伯菌，并對(duì)其致病性進(jìn)行了探究。肺炎克雷伯菌分布廣，并且致病動(dòng)物種類多，對(duì)動(dòng)物健康安全及公共衛(wèi)生安全都造成了不小的威脅。隨著抗生素的逐漸使用，細(xì)菌耐藥性問題逐漸嚴(yán)重。其中肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性問題被許多研究人員關(guān)注。付霞麗對(duì)一株致病性豬源肺炎克雷伯菌的耐藥基因攜帶情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其攜帶SHV耐藥基因，為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌。蘇小艷對(duì)2株大熊貓?jiān)捶窝卓死撞哪退幓蜻M(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中一株細(xì)菌攜帶SHV+TEM+CTX-M-1耐藥基因，另一株攜帶SHV+CTX-M-1耐藥基因。從廣東肇慶某豬場中分離出一株豬源肺炎克雷伯菌，經(jīng)過耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)其攜帶SHV耐藥基因。面對(duì)著肺炎克雷伯菌如此嚴(yán)重的耐藥性問題，研究人員提出了許多對(duì)應(yīng)的解決方法。其中中藥作為我國的瑰寶，其在聯(lián)合抗生素治療肺炎克雷伯菌以及逆轉(zhuǎn)耐藥性上起到了重要作用。金銀花的有效成分綠原酸聯(lián)合左氧氟沙星可有效對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的生物膜起到抑制作用，從而達(dá)到優(yōu)良的抗菌效果。黃連素可有效抑制肺炎克雷伯菌的生長，并且可消除其耐藥質(zhì)粒，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。清金化痰湯與頭孢哌酮或舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌在體外環(huán)境下具有明顯的協(xié)同抑制作用。通過以上的報(bào)道可以看出，中藥單獨(dú)使用或者聯(lián)合抗生素使用，對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，并且能在一定程度上消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒，扭轉(zhuǎn)其耐藥性。

4 結(jié)束語

從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場分離出一株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌，通過耐藥基因檢測，了解其攜帶的耐藥基因及耐藥機(jī)制。通過藥敏及耐藥基因檢測試驗(yàn)，可有效為該肉牛場因該株耐藥菌株產(chǎn)生的疾病防治提供依據(jù)。