阿托伐他汀改善急性心肌梗死后左室收縮功能實(shí)驗(yàn)研究

劉 放，談 紅，晉 群，韓淑芳，陳瑞敏，楊 燕

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地 解放軍第九六〇醫(yī)院，山東 濟(jì)南250031；2.解放軍第九六〇醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟(jì)南250031)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動(dòng)脈急性閉塞、心肌壞死導(dǎo)致的一系列臨床危重情況，即使成功進(jìn)行早期再灌注治療，仍存在心肌細(xì)胞丟失和心臟重構(gòu)等因素致使心臟收縮功能減低，誘發(fā)嚴(yán)重心力衰竭，是影響患者預(yù)后的重要因素。他汀類藥物可改善急性心肌梗死患者的心室重構(gòu)和左室收縮功能[1-2],同時(shí)大量的研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可顯著影響缺血區(qū)組織的血管新生，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)微小RNA(micro RNA,miRNA)與心肌梗死患者心力衰竭的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)[3-4]，他汀類藥物是否通過調(diào)控miRNA的表達(dá)、促進(jìn)梗死心肌組織內(nèi)血管新生而達(dá)到其改善AMI長(zhǎng)期預(yù)后的作用還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究AMI兔接受不同劑量阿托伐他汀治療后，心肌miR-126、miR-221表達(dá)以及血管新生的變化、心功能的改善以及其相關(guān)性，進(jìn)一步深入探討他汀類藥物對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)和心功能改善的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑：Light Cycle 480ⅡPCR擴(kuò)增儀(Roche公司)；Phllip iE33多普勒超聲診斷儀；XDH-3型動(dòng)物用心電圖描計(jì)議；動(dòng)物用無菌手術(shù)器械；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司)；小鼠單克隆CD31一抗(Abcam公司)；羊抗鼠IgG二抗(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒均購自Takara公司；miR-126、miR-221、U6引物由天根生化科技(北京)有限公司合成。

1.1.2 動(dòng)物模型建立：雄性新西蘭大白兔購自濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心[SCK(魯)20150001]，體重3～4 kg。開胸縫扎兔左前降支動(dòng)脈建立急性心肌梗死模型[5]。方法步驟：10%水合氯醛靜脈注射麻醉，仰臥位固定，記錄術(shù)前心電圖。備皮、消毒鋪巾，沿胸骨左緣約1 cm處切開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、胸大肌、胸小肌及肋間肌，鉗夾剪斷第2～4肋骨，充分暴露胸腔，切開并懸吊心包，暴露心臟。于左心耳下緣尋找心大靜脈，左前降支與之伴行，在左心耳下緣1～1.5 cm處結(jié)扎左前降支。有效阻斷血流后可見相應(yīng)心肌節(jié)段由鮮紅色變?yōu)榘导t色，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，同時(shí)描記心電圖，可見胸前導(dǎo)聯(lián)ST段弓背型抬高，AMI模型建立成功，然后逐層關(guān)閉胸腔。手術(shù)中注意避免損傷血管及胸膜而導(dǎo)致大出血及氣胸影響動(dòng)物存活。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：最終成功建立兔心肌梗死模型33只。術(shù)后24 h采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組(AMI組、低劑量阿托伐他汀組和高劑量阿托伐他汀組)，每組11只。AMI組給予等量助溶劑連續(xù)灌胃 4 周，低劑量阿托伐他汀組給予阿托伐他汀鈣片1 mg/(kg·d)，高劑量阿托伐他汀組給予阿托伐他汀2 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃 4 周，對(duì)照組接受假手術(shù)治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲心動(dòng)圖檢查：第28天將兔按照3 ml/kg給予10%水合氯醛耳緣靜脈內(nèi)注射麻醉，M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、每搏輸出量(SV)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.2.2 標(biāo)本采集：超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后處死動(dòng)物，取梗死部位心肌組織標(biāo)本均分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組織化學(xué)染色；另一份心肌組織液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.2.3 心肌組織免疫組化染色和微血管密度(MVD)測(cè)定：每例樣本取同部位切面的5張切片，脫蠟，二甲苯、梯度酒精逐步水化；在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中高壓抗原修復(fù)15 min；玻片置于3%H2O2中，濕盒孵育10 min；滴加小鼠單克隆CD31一抗(1∶100)，濕盒孵育；加羊抗鼠IgG二抗，濕盒孵育；DAB染色，觀察到切片有顏色改變時(shí)，即用自來水洗去染色液；蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，控制染色程度；將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，放入65 ℃烘箱中15 min。每張切片在400倍光鏡下選擇梗死區(qū)5個(gè)血管密度最高的區(qū)域計(jì)數(shù)，其平均值為MVD值，相互分離的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、內(nèi)皮細(xì)胞條索均按1個(gè)微血管計(jì)數(shù)，管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、且?guī)в休^厚肌層的血管則不予計(jì)數(shù)。

1.2.4 miRNA 表達(dá)水平的測(cè)定：采用RT-PCR法檢測(cè)miR-126 和miR-221表達(dá)水平。使用Trizol常規(guī)方法提取組織總RNA，測(cè)定OD值在1.7～2.1。采用兩步法(解鏈-退火延伸)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95 ℃ 30 s，退火和延伸：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用U6作為參照基因，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)置3個(gè)副孔，以2-△△Ct表示樣品中目的基因初始 cDNA 相對(duì)表達(dá)量。所用引物由天根生化科技(北京)有限公司定制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析，各組之間數(shù)據(jù)兩兩比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 建模成功后心電圖表現(xiàn) 結(jié)扎前降支后心動(dòng)圖胸前導(dǎo)聯(lián)ST段弓背型抬高0.2 mV以上，表明兔急性心肌梗死建模成功。

2.2 左室收縮功能檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模28天后，行心臟M型超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定各組心臟左室收縮功能的指標(biāo)，見表1(圖1)。結(jié)果顯示：?jiǎn)我蛩胤讲罘治鲲@示總體各組兔LVEF(F=14.97,P<0.01)、LVFS(F=25.66，P<0.01)、SV(F=25.36，P<0.01)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，其余三組LVFS、SV、LVEF的數(shù)值均顯著降低，經(jīng)阿托伐他汀藥物干預(yù)后，兩組各指標(biāo)均較AMI組明顯升高，以高劑量阿托伐他汀組升高更為明顯，但仍低于對(duì)照組。除LVEF在高劑量和低劑量阿托伐他汀組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，各組之間LVEF、LVFS、SV兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。

表1 各組兔miR-126、miR-221表達(dá)水平、LVFS、SV和LVEF比較

對(duì)照組 AMI組 低劑量阿托伐他汀組 高劑量阿托伐他汀組

2.3 梗死心肌組織中MVD檢測(cè) 結(jié)果經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，被CD31抗體標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞漿無棕色或與背景一致為陰性，細(xì)胞核呈藍(lán)色。對(duì)照組無心肌梗死，故沒有新生血管，僅存在一些固有血管。AMI組MVD為(3.45±1.04)，經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后，低劑量組MVD增加至(5.73±1.49)，高劑量組作用更明顯(7.64±1.81)，見表1。單因素方差分析顯示總體各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.95，均P<0.01)，AMI組、低劑量和高劑量阿托伐他汀組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

2.4 miR-126和miR-221表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，AMI組miR-126的表達(dá)水平(0.63±0.07與1.03±0.06)明顯降低，而miR-221表達(dá)水平明顯升高(1.01±0.04 與 0.38±0.07)，表明心肌梗死后心肌組織中miR-126和miR-221的表達(dá)有顯著變化。經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后，miR-126在低劑量組較AMI組明顯升高(1.87±0.09 與0.63±0.07)，高劑量組升高更明顯(2.44±0.29 與 0.63±0.07)，而且miR-221的變化與之相反，在低劑量組比較AMI組明顯下降(0.75±0.14與1.01±0.04)，高劑量組下降更為顯著(0.43±0.11與1.01±0.04)。單因素方差分析顯示四組之間miR-126(F=256.58,均P<0.01)和miR-221(F=81.66，P<0.01)均值總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較顯示比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見表1。

2.5 MVD和miR-126、miR-221相關(guān)性分析 在高劑量阿托伐他汀組，梗死心肌組織MVD與miR-126表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.703，P<0.05)，與miR-221表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.755，P<0.01)。

3 討 論

AMI是冠心病的急危重癥表現(xiàn)，由冠狀動(dòng)脈血流突然減少甚至閉塞導(dǎo)致，進(jìn)展迅速，病死率高。梗死相關(guān)血管的血運(yùn)重建使梗死心肌得到早期再灌注治療，可降低AMI患者病死率，改善左室收縮功能。但是，有部分患者由于微循環(huán)功能障礙而出現(xiàn)心肌灌注不足，或梗死區(qū)域的頓抑心肌持續(xù)缺血、壞死[5]，影響患者遠(yuǎn)期預(yù)后。AMI 后微血管的形成有利于恢復(fù)缺血心肌的血供，縮小心肌梗死面積，進(jìn)而改善 AMI 后心功能，對(duì)患者的預(yù)后有著重要的臨床意義，促血管新生將心肌梗死的治療帶向一個(gè)新的治療方向[6]。血管新生即從先前的血管構(gòu)造上生長(zhǎng)出新的微血管的過程，它包括3個(gè)連續(xù)的步驟：①血管舒張，血管壁通透性升高，基底膜降解；②內(nèi)皮細(xì)胞激活、增生、遷移；③新管腔形成及重塑[7]。很多調(diào)節(jié)途徑參與其中，如Notch、P13K/Akt和MAPK/ERK等信號(hào)通路[8]。

miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，其通過與相應(yīng)靶基因miRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，影響其降解或后續(xù)的翻譯過程，達(dá)到負(fù)性調(diào)控其基因表達(dá)的作用。有多種miRNA通過調(diào)節(jié)血管新生參與冠心病的發(fā)生和發(fā)展[9]。我們之前的研究也證實(shí)一些miRNA在冠心病和心衰的發(fā)生、發(fā)展、診斷以及預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。調(diào)控新血管形成的特定miRNA有兩大類，一為促進(jìn)新血管形成的miRNA，二為阻止新血管形成的miRNA。有些文獻(xiàn)總結(jié)了與血管新生相關(guān)的miRNAs，其中促血管新生的有miR-17-92、miR-let-7、miR-27b、miR-126、miR-130a、miR-210、miR-296、miR-378、miR-21、miR-31等；抑制血管新生的有miR-15/16、miR-424、miR-221/222、miR-92a、miR-320、miR-200b、miR-217、miR-503、miR-34、miR-214等[12]。miR-126是一種內(nèi)皮特異性的 miRNA，在衰老內(nèi)皮細(xì)胞及其分泌的微顆粒中表達(dá)下調(diào)[13]，而內(nèi)皮衰老是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因素之一；Sun等[14]發(fā)現(xiàn)，來自急性冠脈綜合征(ACS)患者血液中的血小板源性外泌體(PLT-EXO)含有高表達(dá)的miR-126,通過干預(yù) PLT-EXOP中miR-126水平，以減緩斑塊內(nèi)血管新生，這或許為治療ACS提供新的策略；DA-Silva等[15]研究證實(shí)，有氧訓(xùn)練能夠促進(jìn)miR-126表達(dá)增加；miR-126通過間接調(diào)節(jié)VEGF途徑和直接調(diào)節(jié)其參與血管新生有關(guān)信號(hào)途徑(MAPK和P13K/Akt/eNOS等)的靶點(diǎn)，可能參與了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟血管新生。miR-221/222也是在內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的miRNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制干細(xì)胞因子配體c-kit和內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)等基因的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制血管新生和血管形成[16]。Poliseno等[17]研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，miRNA-221/miRNA-222在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮顯著的抗血管新生作用；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-221在經(jīng)血管緊張素Ⅱ治療的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且miR-221的特異性拮抗劑能夠強(qiáng)力阻斷血管緊張素Ⅱ的促血管新生作用,提示miR-221在血管新生中可能具有雙重作用。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在他汀類藥物對(duì)血管新生的影響和miRNA的干預(yù)方面進(jìn)行了大量的研究工作[19-20]。Colakoglu等[21]和Elewa等[22]研究表明，臨床常規(guī)劑量他汀對(duì)缺血誘導(dǎo)的血管新生表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與P13K/Akt通路有關(guān)。Khalighfard等[23]研究報(bào)道阿托伐他汀可通過干預(yù)血管新生傳導(dǎo)通路，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化；在冠狀動(dòng)脈慢血流患者，阿托伐他汀可通過miR-221-VEFG軸促進(jìn)外周循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和增殖[24]。Minami等[25]在對(duì)冠心病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，在給予阿托伐他汀治療后，冠心病患者外周血中的miR-221和miR-222的表達(dá)水平明顯下調(diào)，證明阿托伐他汀可明顯減少外周血中miR-221/miR-222的表達(dá)水平。Pan等[26]報(bào)道阿托伐他汀可以上調(diào)ApoE基因敲除小鼠頸動(dòng)脈粥樣斑塊中miR-126表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)通過建立急性心肌梗死兔模型，并用阿托伐他汀對(duì)心肌梗死兔進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其對(duì)心肌梗死后左室收縮功能的影響，并選取了與內(nèi)皮功能密切相關(guān)的miR-126和miR-221作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可顯著改善左室收縮功能。進(jìn)一步取梗死心肌組織在組織層面研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藥物治療的兔梗死心肌組織中miR-221表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-126表達(dá)顯著上調(diào)，這表明阿托伐他汀同樣可以降低梗死心肌組織中miRNA的表達(dá)。我們進(jìn)一步分析經(jīng)他汀治療后兔的心肌組織miR-221、miR-126的表達(dá)水平與新生血管密度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，新生血管密度與miR-221的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與miR-126表達(dá)呈顯著正相關(guān)，這提示我們阿托伐他汀可能通過影響miR-221、miR-126表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管新生，進(jìn)一步提高左室收縮功能，改善心肌梗死患者的長(zhǎng)期預(yù)后。

綜上所述，本研究證實(shí)阿托伐他汀可改善心肌梗死后的左室收縮功能，其機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)梗死心肌組織miR-221和miR-126的表達(dá)而促進(jìn)血管新生有關(guān)，其相關(guān)傳導(dǎo)通路有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用阿托伐他汀治療AMI提供一定的理論依據(jù)。隨著miRNAs對(duì)血管新生調(diào)控作用的進(jìn)一步闡明，以miRNAs為靶點(diǎn)的治療性血管新生將為冠心病以及血管性疾病的診療提供新的思路。