紅曲米發(fā)酵生產(chǎn)甘蔗果酒及其總酚和抗氧化性測(cè)定

鄭美玲，黃結(jié)，劉梅芳，李楠

1. 廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所（南寧 530001）；2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（南寧 530004）

甘蔗中含有大量糖分，可作為微生物生長(zhǎng)的碳源，也是人類能量代謝的根源[1]。甘蔗中含鐵元素較多，食用甘蔗能改善人體的缺鐵性貧血[2]。甘蔗中存在多種具有生理活性的化合物，如黃酮類、多酚類、單寧以及多糖，使其具有較強(qiáng)的抵抗突變、抵抗氧化和抵抗炎癥的能力，還能夠降低心腦血管疾病的發(fā)生，從而加強(qiáng)人體的免疫系統(tǒng)[3-4]。因此利用甘蔗汁發(fā)酵可以生產(chǎn)富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保健果酒。

紅曲米，又名紅曲，直接在大米上接種紅曲霉發(fā)酵而成[5]。紅曲次級(jí)代謝產(chǎn)物之一的天然紅色色素——紅曲色素（MP），有助于防患癌癥、降血壓血脂、控制肥壯及染色的功能，在食品和醫(yī)藥行業(yè)被大范圍地使用[6]。紅曲中的λ-氨基丁酸（GABA），它是一種能抑制突觸的化學(xué)遞質(zhì)，具有加強(qiáng)記憶力、利于減肥等多種生物活性的功能性氨基酸[7]。紅曲米多用于黃酒、米酒等飲品的釀造，紅曲米應(yīng)用于果酒釀造鮮有相關(guān)報(bào)道[8]。

試驗(yàn)將紅曲米作為發(fā)酵菌種應(yīng)用到甘蔗果酒的釀造，整合紅曲米與甘蔗的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，釀造一款保健值更高的風(fēng)味甘蔗果酒，為果酒增加新的產(chǎn)品，同時(shí)拓寬紅曲米的應(yīng)用范圍，也為拓寬甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)揮重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗汁（廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所提供甘蔗，實(shí)驗(yàn)室壓榨取甘蔗清汁）；紅曲米（云南滲泉調(diào)味食品有限公司）。

1.1.1 試驗(yàn)藥品

葡萄糖（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；福林酚（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；DPPH標(biāo)準(zhǔn)樣品（分析純，美國(guó)Sigma公司）；焦性沒(méi)食子酸（分析純，浙江溫州市甌?；ぴ噭S）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

MC0-40酒精計(jì)（余姚儀表二廠有限責(zé)任公司）；PL303電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Sup-250生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；雷磁pHS-3E型pH酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；TW12恒溫水浴鍋[優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司]；SW-CJ-IBJ單人單面凈化工作臺(tái)（蘇州澤化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗汁的制備

新鮮甘蔗→清洗→壓榨→過(guò)濾→甘蔗清汁→發(fā)酵備用

1.2.2 酒精度的測(cè)定

使用酒精計(jì)法[9]。

1.2.3 殘總糖的測(cè)定

使用DNS法（3, 5-二硝基水楊酸法）[10]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取足量的葡萄糖烘干至恒重后，精確稱取50 mg，用少量蒸餾水溶解并定容到50 mL，即可得到1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取9支試管，分別按照表1操作。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 單位：mL

將各管混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，待冷卻到室溫后，向各管中加蒸餾水到25 mL，搖勻后在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)量吸光度，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，如表2所示。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

如圖1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.579 8x-0.009 3，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 5，說(shuō)明吸光度與葡萄糖含量之間的回歸效果較好，可用于樣品中葡萄糖含量的測(cè)定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 樣品殘總糖含量的測(cè)定

發(fā)酵樣品總糖轉(zhuǎn)化還原總糖：取5 mL的發(fā)酵液于150 mL錐形瓶中，加入10 mL且濃度6 mol/L的HCl溶液，在60 ℃水浴中30 min，待冷卻后，加入10 mL 6 mol/L的NaOH溶液中和，用蒸餾水定容到100 mL，即為總糖轉(zhuǎn)化還原糖溶液。取1 mL轉(zhuǎn)化糖溶液，按表2的方法進(jìn)行殘總糖含量的測(cè)定，經(jīng)過(guò)相關(guān)計(jì)算后即可得到最終的殘總糖含量。

1.2.5 甘蔗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 紅曲米添加量的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），分別添加1%，2%，3%，4%和5%的紅曲米，在溫度28 ℃、甘蔗汁初始pH 4.0條件下，發(fā)酵6 d后測(cè)定殘總糖和酒精度，以確定較佳的紅曲米添加量。

1.2.5.2 發(fā)酵起始pH的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入3%的紅曲米，甘蔗汁的初始pH調(diào)整為3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，在溫度28 ℃條件下發(fā)酵6 d后測(cè)定殘總糖和酒精度，以確定較佳的甘蔗汁初始pH。

1.2.5.3 發(fā)酵溫度的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入3%的紅曲米，調(diào)整甘蔗汁初始pH為4.0，分別在24，26，28，30和32 ℃溫度下，發(fā)酵6 d后測(cè)定殘總糖和酒精度，以確定較佳的發(fā)酵溫度。

1.2.5.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入5%的紅曲米，甘蔗汁起始pH為4.0，調(diào)整溫度28 ℃，分別在發(fā)酵3，4，5，6和7 d后，測(cè)定殘總糖和酒精度，以確定較佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6 甘蔗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以紅曲米添加量（A）、甘蔗汁初始pH（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為考察因素，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化，各因素和水平如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)因素和水平的設(shè)計(jì)

1.2.7 抗氧化性的測(cè)定

采用DPPH法[11-12]。

1.2.7.1 DPPH母液的配制

精準(zhǔn)稱取5 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)樣品，用少量無(wú)水乙醇將其溶解并定容到100 mL，暗光反應(yīng)30 min，即可得到0.05 g/L的DPPH母液。

1.2.7.2 DPPH自由基清除測(cè)定

搖勻后將表4中兩種試劑（對(duì)照液及含樣品液）在暗光的室溫條件下靜置30 min，測(cè)定其在517 nm處的吸光度。清除率按式（1）計(jì)算。

表4 DPPH自由基清除測(cè)定

1.2.8 總酚含量的測(cè)定

采用福林法[13]測(cè)定。

1.2.8.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精準(zhǔn)稱取2 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用少量蒸餾水將其溶解并定容到100 mL，即為20 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取8支試管，分別按照表5操作。

表5 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 單位：mL

充分混勻并靜置5 min后，加入1.5 mL碳酸鈉溶液（20%），搖勻后加蒸餾水至10 mL，在水浴75 ℃下充分反應(yīng)10 min，冷卻后在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，如表6所示。

表6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)

如圖2所示，沒(méi)食子酸標(biāo)曲的回歸方程y=0.103x+0.035 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 7，說(shuō)明吸光度與沒(méi)食子酸含量之間的回歸效果較好，可用于樣品總酚含量的測(cè)定。

圖2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.8.2 樣品中總酚含量的測(cè)定

各取1 mL甘蔗汁和甘蔗果酒，按照1.2.8.1的方法進(jìn)行沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，并經(jīng)過(guò)計(jì)算后得到最終的總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 紅曲米添加量的確定

紅曲米添加量直接影響到發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)速度及其發(fā)酵周期，從而影響發(fā)酵產(chǎn)酒量。由圖3可知，酒精度隨紅曲米添加量的增加先增大后減少。當(dāng)加入3%紅曲米時(shí)，酒精度達(dá)到最高10.7%vol，殘總糖含量為1.43 g/L。其原因有可能是：紅曲米添加量過(guò)少時(shí)，微生物生物量低導(dǎo)致甘蔗糖分轉(zhuǎn)化率低，不利于酒精的產(chǎn)生；紅曲米添加量過(guò)量時(shí)，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大多數(shù)被用于紅曲霉菌體的生長(zhǎng)需要，導(dǎo)致酒精的生成量少[14]。因此較佳的紅曲米添加量在3%左右。

圖3 紅曲米添加量對(duì)酒精度和殘總糖的影響

2.1.2 初始pH的確定

pH會(huì)影響微生物的酶活力甚至影響物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜的難易程度，從而影響酒精的產(chǎn)量。由圖4可知，甘蔗汁的初始pH為4.5時(shí)，酒精度達(dá)到最高14.5%vol，殘?zhí)橇繛?.046 g/L。初始pH＜4.5時(shí)，酒精度隨初始pH的增加而逐漸升高。初始pH＞4.5時(shí)，酒精度隨初始pH的增加而逐漸降低。分析其原因：pH太低或太高容易導(dǎo)致酶失活，繼而影響微生物代謝從而導(dǎo)致酒度低[15]。因此較適宜的甘蔗汁初始pH在4.5左右。

圖4 初始pH對(duì)酒精度和殘總糖的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)和代謝能力有影響。由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酒精度先增加后保持不變。發(fā)酵到達(dá)6 d，產(chǎn)酒精度最高15.3%vol，殘?zhí)橇繛?.65 g/L。分析其原因：發(fā)酵時(shí)間短，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用不充分，轉(zhuǎn)化生成的酒精量少；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗完，生成的酒精量保持不變[16]。因此較合適的發(fā)酵時(shí)間為6 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度和殘總糖的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度的高低直接影響到發(fā)酵菌種的酶活性以及其生長(zhǎng)周期，同時(shí)影響發(fā)酵溶液中的O2濃度、黏度及滲透壓，進(jìn)而影響酒精的產(chǎn)量。由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，酒精度先增加后降低。在28 ℃發(fā)酵溫度下，達(dá)到最高的酒精度15.6%vol，殘?zhí)橇?.52 g/L。分析其原因：發(fā)酵溫度太低，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)代謝弱，轉(zhuǎn)化率低而積累酒精少；溫度過(guò)高，導(dǎo)致微生物代謝降低甚至喪失，導(dǎo)致酒精產(chǎn)量低。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵溫度高時(shí)，發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)周期變短，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸速度加快，酸度增加，從而導(dǎo)致酒度降低[17]。適宜溫度時(shí)，微生物菌株生長(zhǎng)代謝旺盛，有利于糖分轉(zhuǎn)化酒精，因此發(fā)酵溫度28 ℃較為適宜。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度和殘總糖的影響

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

根據(jù)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行發(fā)酵，分別測(cè)定其酒精度，結(jié)果見表7。

表7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

結(jié)果表明，對(duì)酒體酒精度的影響順序?yàn)榧t曲米添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞甘蔗汁初始pH。最適宜的發(fā)酵工藝條件組合為A3B2C1，即紅曲米添加量5%、甘蔗汁起始pH 4.5、發(fā)酵時(shí)間4 d。以最優(yōu)組合A3B2C1條件做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，酒精度為15.6%vol，殘總糖為1.54 g/L。

對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。結(jié)果表明，在選定試驗(yàn)條件下，紅曲米添加量、甘蔗汁初始pH及發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒體酒精度的影響均不顯著（P＞0.05）。但在均不顯著的情況下，紅曲米添加量對(duì)酒體酒精度的影響最大。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 總酚含量測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果得到甘蔗汁的總酚含量27.17 mg/mL，而甘蔗果酒總酚含量為29.44 mg/mL。甘蔗果酒的總酚含量略微大于甘蔗汁。其原因應(yīng)該是紅曲米中菌株生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)，如沒(méi)食子酸、芥子酸、蘆丁等，而乙醇經(jīng)常用作提取總酚的溶劑[18]。甘蔗汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇對(duì)總酚有抽提作用。

圖7 總酚含量的比較

2.4 抗氧化性測(cè)定

自由電子的存在對(duì)人體有害，因?yàn)樗鼤?huì)從細(xì)胞中搶奪電子與之配對(duì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡，而多酚類物質(zhì)，如黃酮、單寧、沒(méi)食子酸及多糖等，其功能基團(tuán)可以與這些自由電子進(jìn)行配對(duì)，因而削弱自由基對(duì)人體的影響。DPPH含有很多的未配對(duì)自由電子，常被用于抗氧化性的測(cè)定。由圖8可知，甘蔗汁的抗氧化性為50%，甘蔗果酒的抗氧化性為62.8%。

圖8 抗氧化性的比較

3 結(jié)論

結(jié)果證明可利用紅曲米發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的甘蔗果酒，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定甘蔗果酒的最佳發(fā)酵條件，同時(shí)比較甘蔗汁和甘蔗果酒的總酚含量及抗氧化性。試驗(yàn)為紅曲米的應(yīng)用增加一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，也為甘蔗汁的發(fā)酵提供一個(gè)可行方法，為營(yíng)養(yǎng)果酒提供新思路。