氫溴酸檳榔堿通過中樞神經(jīng)迷走膽堿能系統(tǒng)促進犬胃腸運動

陳其城，蔣 志，張駿鴻，葉 飛，曹立幸

檳榔堿是中藥檳榔的主要活性成分[1]，其氫溴酸化合物是檳榔堿的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。既往的研究表明，檳榔堿為M3受體激動劑，可促進胃腸道收縮[2]。胃腸運動不僅受腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）調(diào)節(jié)，也受中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的調(diào)控。側(cè)腦室是CNS最大的腦室，通過腦脊液與腦干神經(jīng)核團，特別是迷走神經(jīng)復(fù)合體，包括迷走運動背核（DMV）和孤束核（NTS）有緊密的聯(lián)系[3]。經(jīng)側(cè)腦室微量注射可以了解藥物是否通過CNS發(fā)揮對胃腸運動的作用，Kinzig等[4]使用側(cè)腦室、第四腦室、DMV等注射胃促生長激素的方式，證實了胃促生長激素通過CNS調(diào)控胃腸運動作用。而檳榔堿是否能通過CNS調(diào)控胃腸道運動仍不清楚。本課題組前期已經(jīng)明確氫溴酸檳榔堿有促胃腸動力作用[5-6]，并利用應(yīng)力傳感器建立了犬胃腸移行性復(fù)合運動（MMC）的記錄方法[7]，本研究觀察氫溴酸檳榔堿側(cè)腦室給藥對犬胃腸動力的作用及其中樞調(diào)控胃腸運動的下行通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性12月齡健康比格犬6只，體質(zhì)量（14.0±1.0）kg，購自廣州醫(yī)藥研究總院有限公司實驗動物研究開發(fā)中心。本實驗方案通過廣東省中醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2018003）。

1.2 實驗試劑 氫溴酸檳榔堿（中國阿拉丁公司），阿托品（美國sigma公司），丙泊酚注射液(四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.3 主要儀器 應(yīng)力傳感器（美國Micromeasurements公 司， 型號：J2A-06-S110K-10C）導(dǎo)線連接電橋，并用Porti多通道動態(tài)和靜態(tài)測量系統(tǒng)(荷蘭TMSI公司)記錄胃腸運動信號。不銹鋼胃瘺造管（內(nèi)孔徑2 cm×高4 cm×底盤直徑3.5 cm）。

1.4 犬胃腸運動觀察 術(shù)前2周訓(xùn)練動物，使之適應(yīng)實驗環(huán)境。術(shù)前禁食12 h，先用丙泊酚5 mg/kg基礎(chǔ)麻醉，隨后靜脈灌流10～20 mg/(kg·h)維持麻醉。在無菌條件，氣管插管全麻下完成下列手術(shù): 1)腹部安裝胃瘺管：在賁門下4 cm胃體處安裝一個不銹鋼胃瘺管用于實驗時灌入藥物，以避免動物拒絕口服藥物。2)應(yīng)力傳感器植入：用5個高靈敏度應(yīng)力傳感器分別縫在胃體（胃竇上2 cm）、胃竇(距幽門上2 cm)、近端十二指腸(距幽門下5 cm)、近端空腸(距Treitz韌帶1 cm)及遠端結(jié)腸(降結(jié)腸中部)以記錄胃腸機械收縮活動。應(yīng)力傳感器導(dǎo)線由不銹鋼套管引出體外。3）頸外靜脈插管，使用內(nèi)徑0.1 mm外徑0.15 mm硅膠管，10 U肝素鈉鹽水封管。4）側(cè)腦室、第Ⅳ腦室置管：應(yīng)用腦立體定位儀，于額頂縫、人字縫交點，旁開0.5 cm，使用顱鉆各鉆1孔，放入金屬置管（內(nèi)徑0.2 mm），置管深度1.5 cm，做側(cè)腦室置管，然后使用牙托粉固定。

1.5 干預(yù)方法 1）所有動物先觀察120 min，以記錄各組動物MMC參數(shù)。并在植入傳感器手術(shù)當(dāng)天麻醉狀態(tài)及術(shù)后1 d后清醒狀態(tài)下，在MMC曲線處于Ⅰ相時，從低劑量至高劑量依次給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿（1.25、2.5和5 μg，每次20 μL），每個劑量間隔至少2 h，每只動物重復(fù)2次。2）為了明確氫溴酸檳榔堿的作用是通過膽堿能神經(jīng)起作用，應(yīng)用膽堿能受體拮抗劑阿托品進行阻斷實驗：完成上述觀察后，各組動物先記錄胃腸運動120 min，隨后在靜脈灌流阿托品50 μg/( kg·h)的情況下，按分組給予側(cè)腦室藥物注射后再記錄60 min。3）為了明確氫溴酸檳榔堿的下行通路，進行雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)：完成上述實驗后，待動物恢復(fù)1周后進行雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)，于丙泊酚維持麻醉，氣管插管無菌條件下，動物取仰臥位，從左右頸總動脈仔細(xì)分離迷走神經(jīng)，使用1#絲線結(jié)扎近端和遠端，分別剪去0.5 cm頸迷走神經(jīng)。按1）所述方案重復(fù)觀察。

1.6 觀察指標(biāo) 實驗時將應(yīng)力傳感器與多通道動態(tài)和靜態(tài)測量系統(tǒng)相連，記錄胃腸運動，包括：1）MMC參數(shù)：MMC總時程及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ相時程。2）藥物的作用：計算給藥前后20 min的胃腸運動參數(shù)：（1）收縮波頻率：收縮波頻率=收縮波次數(shù)/時間；（2）平均振幅：振幅之和/收縮波次數(shù)；（3）動力指數(shù)：單位時間收縮波振幅總和，即頻率×平均振幅。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組給藥前后比較均采用配對t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運動的影響 應(yīng)力傳感器植入術(shù)后丙泊酚維持麻醉的情況下，犬胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運動顯著抑制，周期性MMC運動消失，只存在無收縮運動的Ⅰ相樣靜息期；給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg后，均可增強犬胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運動，Ⅰ相靜息期運動模式立即轉(zhuǎn)變?yōu)棰笙鄻痈哒穹哳l率收縮模式，收縮持續(xù)5～10 min（圖1）。分別與給藥前和生理鹽水比較，除外1.25 μg的劑量，2.5 μg和5 μg的氫溴酸檳榔堿側(cè)腦室注射后，胃腸收縮動力指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖2）。

圖1 麻醉狀態(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運動曲線的影響

圖2 麻醉狀態(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸動力指數(shù)的影響

在MMC Ⅰ相時給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg，與麻醉狀態(tài)相比較，清醒狀態(tài)下給予氫溴酸檳榔堿不同劑量均可產(chǎn)生更強烈、更持久的收縮（圖3），與給藥前比較，較低劑量（1.25 μg）氫溴酸檳榔堿即可顯著增強胃體、胃竇、十二指腸和空腸收縮動力指數(shù)（均P＜0.05，圖4）。與麻醉狀態(tài)比較，清醒狀態(tài)下給予1.25 μg氫溴酸檳榔堿可使胃腸動力指數(shù)增加66.94%～132.06%。

圖3 清醒空腹?fàn)顟B(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運動曲線的影響

圖4 清醒空腹?fàn)顟B(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸動力指數(shù)的影響

2.2 阿托品完全阻斷側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運動的增強作用 經(jīng)靜脈一次性注射阿托品50 μg/kg，并持續(xù)灌流阿托品50 μg/(kg·h)以維持胃腸運動抑制效果（圖5）。灌流阿托品10 min后，側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg均不能增強胃腸收縮運動。

圖5 阿托品完全阻斷側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運動的增強作用

2.3 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運動情況 典型的空腹?fàn)顟B(tài)下清醒犬MMC如圖6所示，MMC主要由Ⅰ相靜息期，Ⅱ相間斷收縮期，Ⅲ相高振幅高頻率收縮期和IV相恢復(fù)期組成。胃竇Ⅲ相收縮波可向下傳播，使十二指腸、空腸甚至結(jié)腸產(chǎn)生移行性運動。切斷犬頸雙側(cè)迷走神經(jīng)并不能廢除胃腸MMC運動，MMC靜息和運動交替現(xiàn)象依舊存在（圖7）。迷走神經(jīng)切斷術(shù)后，犬MMC運動周期明顯延長，尤其是Ⅰ相持續(xù)時間顯著延長（表1），胃體和胃竇Ⅲ相收縮持續(xù)時間減少，平均收縮振幅分別由（26.74±3.37）g和（22.33±2.60）g下降至（17.42±2.18）g和（15.20±1.44）g；而十二指腸、空腸則Ⅲ相收縮與正常對照比較差異不顯著，結(jié)腸簇狀收縮間隔時間明顯延長（表1）。

表1 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸MMC運動周期

圖6 清醒犬空腹?fàn)顟B(tài)下犬胃腸MMC曲線圖

圖7 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸MMC曲線圖

2.4 側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運動的影響 切斷雙側(cè)頸迷走神經(jīng)后給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg后，均未能使胃體至結(jié)腸產(chǎn)生明顯收縮增強（均P＞0.05，圖8）。

圖8 側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運動的影響

3 討論

檳榔堿是中藥檳榔主要的藥理活性成分，含量在0.1%～0.5%之間[1]，檳榔的生物堿難溶于水，檳榔堿在堿性條件下易分解為檳榔次堿和去甲檳榔堿，遇酸可以形成類似于鹽的物質(zhì)[8]，通常以結(jié)合鹽的形式存在，氫溴酸檳榔堿為其穩(wěn)定的化合物?！吨袊幍?020年版》規(guī)定，以氫溴酸檳榔堿作為對照品，檢測得檳榔中檳榔堿含量不得少于0.2%。因此，大多數(shù)研究也利用氫溴酸檳榔堿研究檳榔堿的含量及藥理學(xué)活性[9-10]。

檳榔堿是我院制劑五達顆粒的主要活性成分之一，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（445.27±12.39）μg/g[11]，可能是其產(chǎn)生促胃腸動力作用的主要物質(zhì)。通過胃腸肌條離體實驗已經(jīng)證實，氫溴酸檳榔堿可以通過M3受體增強小鼠[2]和大鼠[5]胃腸肌條收縮運動。利用ICC細(xì)胞缺乏的W突變小鼠證明，氫溴酸檳榔堿促進小鼠小腸收縮的作用也與抑制電壓門控鉀離子通道，使平滑肌慢波去極化有關(guān)[6]。這些對檳榔堿的研究大多都是在組織及細(xì)胞水平完成的，使用應(yīng)力傳感器植入的方式實時記錄在體動物胃腸機械運動能更好的反映藥物的效果[7,12]。本課題組前期研究用應(yīng)力傳感器實時記錄了比格犬[7]和小鼠[12]的胃腸機械運動，本研究記錄麻醉及清醒狀態(tài)犬胃腸運動的情況，其中清醒犬的MMC數(shù)據(jù)可與經(jīng)典文獻相互印證[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室給予氫溴酸檳榔堿可以顯著增加胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運動，表明氫溴酸檳榔堿具有中樞促胃腸動力作用。該效應(yīng)可被阿托品完全阻斷，這提示檳榔堿主要是通過迷走神經(jīng)膽堿能通路起作用的。神經(jīng)追蹤技術(shù)表明，為胃腸道提供副交感神經(jīng)支配的迷走神經(jīng)運動神經(jīng)元起源于DMV[14]。而DMV神經(jīng)元的活動，以及迷走神經(jīng)的傳出活動，也受到來自腦干和中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級核團的突觸輸入的調(diào)節(jié)[15]。在麻醉條件下，DMV神經(jīng)元由持續(xù)的抑制性氨基丁酸(GABA)能輸入調(diào)節(jié)，這些抑制性輸入主要來自于鄰近的NTS[16]。丙泊酚可以激活GABA受體，產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制[17]，抑制性的GABA能神經(jīng)通過DMV支配胃腸運動[18]，并使周期性的移行性復(fù)合運動消失。而在丙泊酚維持麻醉的情況下，給予側(cè)腦室注射檳榔堿依然可以產(chǎn)生顯著的胃腸運動增強作用，這表明GABA能神經(jīng)不參與檳榔堿的中樞效應(yīng)。

位于側(cè)腦室的迷走神經(jīng)復(fù)合體含有DMV和NTS兩個核團，是迷走神經(jīng)傳入和傳出中樞的通路[19]，若將迷走神經(jīng)切斷，則這一通路即被阻斷，中樞對胃腸運動的調(diào)控能力也被削弱。本實驗也證實，切斷雙側(cè)頸迷走神經(jīng)后，犬胃腸MMC周期延長，MMC II/Ⅲ相收縮期振幅、頻率和動力指數(shù)明顯下降，提示中樞迷走-迷走反射可能參與胃腸MMC的調(diào)節(jié)。而且通過手術(shù)切斷頸雙側(cè)迷走神經(jīng)阻斷其下傳通路[20]后，側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運動的增強作用也被完全阻斷，表明檳榔堿的作用是通過中樞迷走神經(jīng)復(fù)合體及其迷走-迷走反射通路實現(xiàn)的。

綜上，檳榔堿側(cè)腦室給藥可以劑量依賴性地增強胃體至結(jié)腸的收縮運動，該效應(yīng)可能是通過迷走膽堿能神經(jīng)下行通路而實現(xiàn)的，但是CNS的許多核團（如孤束核、下丘腦、迷走神經(jīng)背核、延髓極后區(qū)等）[3]以及脊髓交感神經(jīng)[21]也能通過下行通路調(diào)節(jié)胃腸運動。而檳榔堿是通過中樞哪一核團支配胃腸道動力，是否通過脊髓交感神經(jīng)通路，這仍需要后續(xù)進一步的實驗研究。