響應(yīng)面法優(yōu)化含活性肽CC34畢赤酵母重組菌凍干營(yíng)養(yǎng)保護(hù)劑的研究

李 爽，杜家華，白志輝，曲 可，蘇 苗，姜 寧，張愛忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319)

肽是2個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連構(gòu)成的化合物，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可以發(fā)揮重要的生理功能。具有生物活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性肽，其種類繁多，其中宿主防御肽就是一種可以通過(guò)誘導(dǎo)生物體發(fā)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的小分子多肽[1]?；钚噪牡纳飳W(xué)功能十分多樣，具有能抵抗多種細(xì)菌、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)[2]，在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝中發(fā)揮著重要作用。將活性肽轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中可以提高活性肽在重組菌中的表達(dá)量[3]。為了保證菌種的質(zhì)量，保持菌種的活力，選用正確的菌種保存方法和技術(shù)十分重要，而凍干菌粉便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用，在實(shí)踐和研究中取得了理想的效果[4-5]。冷凍干燥技術(shù)一直是生產(chǎn)干燥細(xì)菌粉末的經(jīng)典方法，也被證明是保存細(xì)菌最方便和成功的方法，然而干燥過(guò)程是在低溫下進(jìn)行的，細(xì)菌菌體可能會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的損害[6]，而且并非所有菌株都能存活或保留功能活性，如生物防治活性、冷凍干燥后的酶活性和酸化活性[7]。在冷凍干燥的低溫環(huán)境下，由于細(xì)胞內(nèi)鹽濃度增加，胞內(nèi)的水分會(huì)隨之向胞外滲透，滲透出的水遇冷形成冰晶，這種滲透休克是細(xì)胞活力喪失的主要原因[8]。低溫保護(hù)劑能將微生物固定在具有高黏度和低流動(dòng)性反應(yīng)的材料中，可防止細(xì)胞活力喪失。在低溫保護(hù)劑成分中，蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、谷氨酸鈉、抗壞血酸和脫脂乳粉是凍干酵母和畢赤酵母屬最常用的保護(hù)劑[9]。Abadias等[10]研究表明，添加10%脫脂乳粉對(duì)念珠菌CPA-1有較好的凍干保護(hù)效果。張菊等[11]用復(fù)合保護(hù)劑(含脫脂乳粉20%、海藻糖10%、甘油2%和低聚木糖5%)保護(hù)植物乳桿菌，可使其凍干存活率達(dá)到80%以上。陳合等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.6%的山梨醇可以使雙歧桿菌凍干存活率達(dá)到77%。但凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果因微生物菌株而異，目前鮮見有關(guān)基因重組畢赤酵母菌凍干保護(hù)劑的研究。本實(shí)驗(yàn)室前期獲得了含活性肽CC34的畢赤酵母菌重組菌[13]，為了能使其更好地應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，本研究擬通過(guò)單因素篩選結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化凍干畢赤酵母重組菌保護(hù)劑配方，使其具備高穩(wěn)定性和高活力，以期為含活性肽CC34畢赤酵母重組菌商業(yè)化生產(chǎn)提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

含活性肽CC34畢赤酵母重組菌：將活性肽CC34利用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌SMD1168中，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供；脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇、谷氨酸鈉均購(gòu)自北京博奧拓科技有限公司；YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸出粉1%，葡萄糖2%；YPD固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉即可，YPD液體及固體培養(yǎng)基115 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 畢赤酵母重組菌活化 將置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解凍。用接種環(huán)沾取菌液后在YPD固體培養(yǎng)基上平板劃線，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。用接種環(huán)挑取單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下220 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.2 畢赤酵母重組菌的凍干及復(fù)水 畢赤酵母重組菌30 ℃條件下220 r/min搖床培養(yǎng)18 h，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液收集菌泥。按照菌泥∶保護(hù)劑=1∶2比例加入凍干保護(hù)劑，取1 mL分裝至西林瓶后用膠塞密封處理，于-20 ℃預(yù)凍3 h后放入真空冷凍干燥機(jī)(冷凍溫度為-56 ℃、真空度為1 Pa)凍干24 h。凍干成粉后加入YPD液體培養(yǎng)基至凍干前體積。

1.2.3 單一保護(hù)劑的篩選 將4種單一保護(hù)劑加入無(wú)菌水配制到所需濃度(W/V)，具體為：脫脂乳粉濃度1%、5%、10%、15%、20%，海藻糖濃度5%、10%、15%、20%、25%，山梨醇濃度5%、10%、15%、20%、25%，谷氨酸鈉濃度1%、2%、3%、4%、5%，于115 ℃滅菌15 min。按照1.2.2的方法制備凍干菌粉，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法考察單一保護(hù)劑在不同濃度下的保護(hù)效果。根據(jù)單因素試驗(yàn)保護(hù)效果排序，選擇效果較好的前3種凍干保護(hù)劑為最優(yōu)單因素進(jìn)行下一步的復(fù)配試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化畢赤酵母重組菌凍干保護(hù)劑配比 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從4種單一保護(hù)劑中選擇保護(hù)效果較好的3種：脫脂乳粉、海藻糖和山梨醇，分別設(shè)定為變量A、B、C，畢赤酵母重組菌的凍干存活率為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert 12軟件設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，12組為析因點(diǎn)試驗(yàn)，5組為重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)各因素水平表Table 1 Test factors and levels %

1.3 測(cè)定指標(biāo)

活菌計(jì)數(shù)采用YPD液體培養(yǎng)基復(fù)水至原體積；菌種計(jì)數(shù)采用梯度稀釋平板法；菌體存活率計(jì)算公式為：

酵母存活率(%)=(冷凍干燥后每毫升菌液活菌數(shù)/冷凍干燥前每毫升菌液活菌數(shù))×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)的分析和回歸模型的建立；采用SPSS 23.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA、Tukey’s 檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析和多重比較，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，每次2個(gè)平行樣，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 脫脂乳粉對(duì)畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1A可知，與空白組相比，添加不同濃度的脫脂乳粉對(duì)畢赤酵母重組菌凍干存活率均有顯著提高(P<0.05)。在0～10%范圍內(nèi)，菌體凍干存活率隨脫脂乳粉濃度的增加而提高，當(dāng)脫脂乳粉濃度達(dá)到10%時(shí)凍干存活率最大，為51.23%。但當(dāng)脫脂乳粉濃度超過(guò)10%時(shí)，凍干存活率隨脫脂乳粉濃度的增加反而下降。

2.1.2 海藻糖對(duì)畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1B可知，與空白對(duì)照組相比，添加海藻糖對(duì)提高畢赤酵母重組菌凍干存活率均起到了顯著的效果(P<0.05)，海藻糖濃度為10%、15%、20%時(shí)保護(hù)效果較好。當(dāng)海藻糖濃度增加到15%時(shí)凍干存活率最大，為67.50%，但當(dāng)海藻糖濃度超過(guò)15%時(shí)，畢赤酵母重組菌的存活率呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。

2.1.3 山梨醇對(duì)畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1C可知，山梨醇濃度在0～20%的范圍內(nèi)，隨著山梨醇濃度的增加，畢赤酵母重組菌凍干存活率逐漸提高，當(dāng)山梨醇濃度為20%時(shí)，畢赤酵母重組菌凍干存活率最高，為52.19%，顯著高于其他濃度條件下的凍干存活率(P<0.05)。

2.1.4 谷氨酸鈉對(duì)畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1D可知,當(dāng)谷氨酸鈉添加量為1%時(shí)，凍干保護(hù)效果與空白組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；當(dāng)添加量為3%時(shí)，畢赤酵母重組菌凍干存活率最大，為36.92%，顯著高于其他各組(P<0.05)。

添加以上4種凍干保護(hù)劑均起到了較好的保護(hù)效果，保護(hù)劑保護(hù)效果排序?yàn)楹Ｔ逄?山梨醇>脫脂乳粉>谷氨酸鈉。選擇前3種凍干保護(hù)劑為最優(yōu)單因素，進(jìn)行下一步的復(fù)配方案。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合凍干保護(hù)劑配比

以3種保護(hù)劑進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，共17組，12組為析因點(diǎn)試驗(yàn)，5組為重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)，分別測(cè)定畢赤酵母重組菌凍干存活率，結(jié)果見表2。采用Design Expert 12.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到菌體存活率(Y)對(duì)脫脂乳粉(A)、海藻糖(B)、山梨醇(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=76.20+6.57A+4.18B+0.60C-1.83AB-1.19AC+2.94BC-20.94A2-14.23B2-11.37C2。

①A、B、C和D分別為脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇和谷氨酸鈉的效應(yīng)。②肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05) ①A,B,C and D indicated the effects of skim milk powder,trehalose,sorbitol and sodium glutamate,respectively. ②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant differences圖1 不同凍干保護(hù)劑對(duì)畢赤酵母重組菌存活率的影響Fig.1 Effects of different freeze-drying protectants on the survival rate of recombinant Pichia pastoris

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

續(xù)表

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

通過(guò)軟件Design-Expert 12.0繪制脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇對(duì)畢赤酵母重組菌體存活率的交互作用和響應(yīng)面分析圖(圖2)。由圖2可知，3個(gè)響應(yīng)面均具有極值點(diǎn)，都為開口向下的凸形球面。根據(jù)響應(yīng)面建立的數(shù)學(xué)模型分析，最佳的凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳粉濃度為10.75%、海藻糖濃度為15.70%、山梨醇濃度為20.19%，在此條件下預(yù)測(cè)菌體存活率為77.00%。

圖2 脫脂乳粉、海藻糖以及山梨醇交互作用等高線圖及相應(yīng)響應(yīng)面圖Fig.2 Contour maps and corresponding response surface maps of interaction of skim milk powder,trehalose and sorbitol

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

將畢赤酵母重組菌按篩選出的最優(yōu)配比進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，畢赤酵母重組菌平均存活率為(78.98±1.63)%。

3 討 論

徐穎等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著脫脂乳粉濃度的增加，脫脂乳粉對(duì)富硒鼠李糖乳桿菌的保護(hù)效果也隨之提高，達(dá)到飽和后，隨著脫脂乳粉濃度的提高，菌體的存活率趨于穩(wěn)定或些許下降。脫脂乳粉是一種常見的大分子胞外保護(hù)劑[15]，在凍干過(guò)程中脫脂乳粉可以在菌體表面自然形成保護(hù)層以防止菌體受到損害，而且脫脂乳粉當(dāng)中還含有大量的蛋白和糖類對(duì)細(xì)胞起到固定作用，蛋白和糖類能減少細(xì)胞與介質(zhì)的接觸面積，增強(qiáng)細(xì)胞壁免遭損傷，避免細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)滲漏[16]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)脫脂乳粉濃度達(dá)到10%時(shí)凍干菌存活率最高，之后隨濃度繼續(xù)增加其保護(hù)效果反而降低，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本方面的考慮，脫脂乳粉濃度選擇10%比較適宜。

海藻糖作為一種雙糖，在菌體失水的情況下，海藻糖能夠與菌體失水點(diǎn)通過(guò)氫鍵相連形成新的保護(hù)層，降低冰晶的形成損壞細(xì)胞膜，充分起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用[17]。在蛋白質(zhì)冷凍的過(guò)程中能填充到因蛋白質(zhì)失水而形成的空缺中，從而有效地抑制微生物中的蛋白質(zhì)在冷凍過(guò)程中發(fā)生的變性[18]。張瑤等[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻糖作為單一保護(hù)劑且濃度為12%時(shí)，對(duì)植物乳桿菌V02保護(hù)效果最好。從本試驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)海藻糖在15%時(shí)，對(duì)畢赤酵母重組菌起到了較好的保護(hù)效果。

對(duì)于不同的菌種，保護(hù)劑的保護(hù)能力不盡相同。山梨醇具有良好的保濕性能，可以與水分子結(jié)合，同時(shí)能夠極易滲透進(jìn)微生物的細(xì)胞內(nèi)部[20]，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的山梨醇使其內(nèi)部的黏性更強(qiáng)，黏稠度高可抑制水形成冰晶，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受損壞，還可以維持細(xì)胞的活性[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，20%的山梨醇對(duì)畢赤酵母重組菌起到了顯著的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)通過(guò)單因素篩選試驗(yàn)初步確定了所選取的凍干保護(hù)劑的濃度范圍，然后結(jié)合響應(yīng)面分析得出3種保護(hù)劑(脫脂乳粉、海藻糖和山梨醇)的最優(yōu)濃度。三者的相互結(jié)合使得菌體的存活率得到更穩(wěn)固的保障。響應(yīng)面曲面圖直觀反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，曲面圖越陡表示交互作用越強(qiáng)，曲面圖越平則表示交互作用越弱。本試驗(yàn)對(duì)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，使用10.75%的脫脂乳粉、15.70%的海藻糖和20.19%的山梨醇作為活性肽CC34畢赤酵母重組菌的凍干保護(hù)劑，菌體存活率為78.98%，與響應(yīng)面法的預(yù)測(cè)值77.00%接近，說(shuō)明利用響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型可信度較高。

許多研究表明，單獨(dú)使用一種保護(hù)劑通常不能很好地保護(hù)菌株在冷凍干燥過(guò)程中的穩(wěn)定性。不同的冷凍參數(shù)也會(huì)對(duì)相同菌株產(chǎn)生不同的應(yīng)力反應(yīng)。因此，在選擇保護(hù)劑時(shí)要考慮能否保持菌株穩(wěn)定、保護(hù)劑能否起到保護(hù)作用、配方成本最低等。在實(shí)際應(yīng)用中，可以選擇多種保護(hù)劑以復(fù)配的方式來(lái)提高菌體凍干存活率。如糖類保護(hù)劑與蛋白質(zhì)易產(chǎn)生氫鍵，但緩沖能力比較弱，這時(shí)可以用氨基酸類保護(hù)劑進(jìn)行彌補(bǔ)[22]。因此，在冷凍干燥過(guò)程中選擇最優(yōu)配方和最佳凍干工藝，不僅能最大限度地提高菌株穩(wěn)定性，還能控制保護(hù)劑成本。

4 結(jié) 論

畢赤酵母重組菌復(fù)合凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳粉濃度為10.75%，海藻糖濃度為15.70%，山梨醇濃度為20.19%。采用響應(yīng)面法預(yù)測(cè)出的菌體凍干存活率為77.00%，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)獲得的菌體凍干存活率達(dá)到78.98%。該復(fù)合凍干保護(hù)劑可用于對(duì)畢赤酵母重組菌的保存和后續(xù)試驗(yàn)的研究。