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    電針對圍絕經(jīng)期失眠大鼠睡眠覺醒腦電圖及血清性激素水平的影響

    2022-10-20 03:47:42于心同楊文佳陳云飛
    陜西中醫(yī) 2022年10期
    關鍵詞:動情周期時相絕經(jīng)期

    于心同,楊文佳,趙 娜,陳云飛

    (上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200437)

    圍絕經(jīng)期是女性一生中一個特殊時期,從閉經(jīng)前第一次月經(jīng)不規(guī)律開始,至閉經(jīng)1年后結束[1]。失眠是圍絕經(jīng)期女性常見的癥狀,圍絕經(jīng)期睡眠障礙的患病率與文化和種族密切相關[2],在我國患病率高達51%~55%[3-4],在美國患病率為31%~42%[5],日本為28%,韓國為15.9%[6]。失眠不僅會影響患者心理健康,還會增加心臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率[7-8]。圍絕經(jīng)期失眠(Perimenopausal insomnia,PMI)常與抑郁、潮熱、疲勞、食欲下降/增加、體重減輕/增加、夜尿癥共存,并可增加與失眠有關的危害[9-10]。研究表明較低的雌二醇和較高的黃體生成激素水平與圍絕經(jīng)期失眠顯著相關,但病理機制尚不明確[11-12]。激素替代療法被圍絕經(jīng)期失眠患者廣泛使用,但隨著激素的應用,其弊端日益顯現(xiàn),從短期治療來看,子宮出血和乳房觸痛是最主要的不良反應[13-14]。針灸治療PMI療效顯著[15-16],其通過審因論治、辨證取穴,在改善主客觀睡眠指標、啟動內(nèi)源性的調節(jié)機制等方面占有明顯優(yōu)勢,針灸通過內(nèi)源性雌激素的調節(jié)大大減少了外源性雌激素導致的各種疾病的風險,明顯提高了臨床治療PMI的安全性和有效性。電針治療PMI的報道眾多、療效肯定,但對大鼠睡眠覺醒腦電圖的改善報道描述不詳[17]。本研究通過客觀觀察模型大鼠睡眠覺醒腦電圖(睡眠覺醒時程、睡眠覺醒累積量、不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)、睡眠覺醒時相轉換次數(shù))及血清性激素的水平來探討電針對PMI大鼠睡眠覺醒的調節(jié)作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物:SPF級雌性SD大鼠,體重(200±20)g,由上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SCXK(滬)2018-0040。實驗動物分籠飼養(yǎng)在睡眠覺醒生物解析系統(tǒng)(腦電圖監(jiān)測專用飼養(yǎng)籠)。飼養(yǎng)環(huán)境:恒溫(24±1)℃、恒濕(60±2)%、隔音、靜電屏蔽、7:00 am至7:00 pm(12 h/12 h)明亮黑暗周期(光照度≈100 lux),連續(xù)進行大鼠生殖道脫落細胞學觀察動情周期,出現(xiàn)典型的動情周期納入本實驗研究。實驗過程中嚴格遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。適應性飼養(yǎng)后1周后進行實驗。

    1.1.2 主要實驗試劑與儀器:義齒基托樹脂 (批號160508,上海張江生物材料有限公司),牙脫粉(批號140316,上海張江生物材料有限公司),戊巴比妥鈉(批號20200422,美國默克公司),青霉素鈉(批號H13020655,華北制藥股份有限公司),大鼠FSH、LH、E2ELISA試劑盒(批號202007,上海哈靈生物科技有限公司),腦立體定位儀(美國Stoelting公司),電鉆(28505,PROXXONGET日本株式會社),Neuro Log放大器(Digitimer),睡眠生物解析系統(tǒng)(日本Biotex公司),電腦記錄睡眠軟件(日本Biotex公司),華佗牌 0.3 mm×13 mm一次性使用無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),電針治療儀(G6805-1A,上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 建模及分組:采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機均分為對照組、模型組、電針組和假電針組,每組各10只。除對照組外,其余各組大鼠采用雙側卵巢切除的方法構建PMI大鼠模型[18-19]。具體方法:戊巴比妥鈉40 μg/g腹腔麻醉,背部手術區(qū)域剃毛、75%酒精消毒,大鼠脊柱與兩側髂嵴最高點連線的交點作為標記點,向上做2~3 cm的縱行切口,分離皮膚與筋膜,脊柱標記點左右各旁開1 cm,鈍性分離腰肌,完整提出卵巢組織并結扎,切除雙側卵巢,注意包膜是否完整,常規(guī)縫合后,傷口處以青霉素處理。對照組采用假手術的方法,摘除卵巢周圍少量脂肪組織,并確保卵巢及包膜保持完整。術后恢復3 d,所有大鼠每天行陰道涂片觀察生殖道脫落細胞,判定動情周期變化。模型組、電針組和假電針組大鼠陰道涂片連續(xù)1周無成熟脫落細胞,證明手術成功。對照組術后出現(xiàn)典型的動情周期變化,證明假手術成功。四組大鼠手術后給予無大豆飲食以排除大豆植物雌激素的影響。

    1.2.2 大鼠腦電圖記錄電極埋置術:四組大鼠均行腦電圖記錄電極埋置術[20],戊巴比妥鈉40 μg/g腹腔麻醉動物,將大鼠固定于腦立體定位儀上,頭部剪毛,消毒,縱行剪開頭部皮膚,剝離皮下組織,刮除骨膜,充分暴露顱骨,植入腦電圖記錄電極并埋入肌電記錄線。皮層腦電圖電極(采用不銹鋼針)植入左側頂葉皮層兩點(lambda 前方和側面各2 mm),額葉皮層(bregma前方和側面各2 mm)來記錄前頂葉腦電活動。將2個直徑1 mm的不銹鋼螺絲釘植入顱骨內(nèi),在額骨正中鉆孔安置接地電極。另一對電極線被附著在頸部肌肉以測量肌電活動。用牙科水泥將電極固定于顱骨上,術后2 d內(nèi)予以抗生素。大鼠術后在睡眠生物解析系統(tǒng)內(nèi)恢復10 d。同時按照12 h/12 h明暗周期飼養(yǎng)(7:00 am至7:00 pm)。

    1.2.3 干預方法:對照組和模型組正常飼養(yǎng),不予電針干預。電針組:造模及電極埋置術后第10天,取雙側“安眠穴”(EX-HN18) ,安眠穴位于翳風與風池兩穴連線之中點[21],取穴定位參照李忠仁主編《實驗針灸學》,用0.5寸(針身長13 mm)30號毫針斜刺,每天上午8:00~10:00接G6805-Ⅱ型電針儀,連續(xù)波,2 Hz,電壓2 V,強度以大鼠頸部輕微振動、無嘶叫為度,正負極分別接兩側“安眠穴”,每天1次,每次20 min,共治療7次。假電針組:按照參考文獻[22],將針灸針刺入大鼠穴位皮下后連接電針,但不予通電,其余操作同上述電針組方法。

    1.2.4 動情周期監(jiān)測:采集陰道分泌物進行涂片,右手持吸有少量0.9%氯化鈉溶液的光滑吸管。將其緩慢沖入陰道內(nèi)沖洗數(shù)次,吸取少量陰道液并緩慢抽出,均勻涂抹于載玻片上,干燥后放入盛有95%乙醇的盒內(nèi)固定,采用巴氏染色法,光鏡下觀察大鼠陰道上皮細胞的變化情況,用于監(jiān)測大鼠的動情周期。

    1.2.5 血清FSH、LH、E2水平檢測:末次電針治療后,深度麻醉大鼠,腹主動脈取血。室溫血液自然凝固10~20 min,離心20 min(2000~3000 r/min),仔細收集血清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心。應用雙抗體夾心法測定,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中大鼠血清FSH、LH、E2水平。

    1.2.6 腦電圖記錄與分析:經(jīng)睡眠生物解析系統(tǒng)記錄完成的大鼠腦電(EEG)和肌電(EMG)信號經(jīng)系統(tǒng)放大、濾波、數(shù)模轉換后,用軟件實時記錄。EEG/EMG記錄結束后,運用分析軟件,按統(tǒng)一設定的標準自動掃描判別出覺醒(Wake)、快速眼動睡眠(REMs)和非快速眼動睡眠(NREMs)。自動掃描完成后,進行人工檢查,綜合判讀腦電與肌電,必要時改正[20]。

    1.2.7 大鼠24 h睡眠覺醒時程分析:觀察睡眠覺醒量,分析睡眠覺醒晝夜節(jié)律以及睡眠異常出現(xiàn)的時間。以晝夜24 h為橫坐標,以每小時各睡眠覺醒時相的量為縱坐標,繪制出24 h時程曲線。

    1.2.8 大鼠睡眠覺醒累積量分析:觀察睡眠覺醒量,分析晝夜12 h/12 h各個時相的累積量,如數(shù)據(jù)點集中出現(xiàn)在某一區(qū)段,則計算這一區(qū)段的睡眠覺醒累積量,繪制出直方圖。睡眠覺醒累計量直方圖反應的是晝夜12 h/12 h或是某一時間段的睡眠變化。

    1.2.9 大鼠不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù):觀察睡眠覺醒結構,分析不同時長睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù),考察睡眠狀態(tài)維持的能力。

    1.2.10 大鼠睡眠覺醒時相轉換次數(shù):觀察睡眠覺醒結構,分析各睡眠覺醒時相之間的轉換次數(shù),考察睡眠的穩(wěn)定性、中途覺醒等。

    2 結 果

    2.1 各組大鼠動情周期變化比較 見表1。電針后,與對照組比較,模型組、電針組和假電針組大鼠動情周期紊亂率顯著增高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠動情周期紊亂率顯著降低(P<0.05)。

    表1 各組大鼠動情周期變化比較

    2.2 各組大鼠24 h睡眠覺醒時程比較 見圖1。電針后,與對照組比較,模型組和假電針組大鼠24 h睡眠覺醒晝夜節(jié)律減弱,白天覺醒增多,NREMs減少,尤其在白天的12:00和17:00覺醒增多、11:00和17:00 NREMs減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較,電針組24 h睡眠覺醒晝夜節(jié)律趨勢接近對照組,白天12:00和17:00覺醒減少、11:00和17:00 NREMs增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

    A:各組大鼠24 h覺醒時間;B:各組大鼠24 h REM睡眠時間;C:各組大鼠24 h NREM睡眠時間。與對照組比較,*P<0.05,△P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,▲P<0.01

    2.3 各組大鼠睡眠覺醒累積量比較 見圖2。電針后,與對照組比較,模型組和假電針組大鼠睡眠覺醒累積量在12 h白天和24 h全天覺醒增多、NREMs減少(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠在12 h白天和24 h全天覺醒減少、NREMs增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    A:各組大鼠白天、夜間、全天覺醒時間累積量;B:各組大鼠白天、夜間、全天REM睡眠時間累積量;C:各組大鼠白天、夜間、全天NREM睡眠時間累積量。與對照組比較,△P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,▲P<0.01

    2.4 各組大鼠不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)比較 見圖3。電針后,與對照組比較,模型組和假電針組大鼠NREMs在12 h白天和12 h夜間睡眠片段化明顯,短時程次數(shù)增多、長時程次數(shù)減少,尤其短時程(0~16 s)增多、長時程(64~128 s)減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠在12 h白天和12 h夜間睡眠片段化恢復,短時程(0~16 s)減少、長時程(64~128 s)增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    A:各組大鼠白天不同時長NREM睡眠片段發(fā)生次數(shù);B:各組大鼠夜間不同時長NREM睡眠片段發(fā)生次數(shù);C:各組大鼠白天不同時長REM睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù);D:各組大鼠夜間不同時長REM睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù)。

    2.5 各組大鼠睡眠覺醒時相轉換次數(shù)比較 見圖4。 電針后,與對照組比較,模型組和假電針組大鼠12 h白天慢波睡眠到覺醒(S-W)之間的轉換增多(P<0.05,P<0.01),與模型組比較,電針組大鼠在12 h白天 S-W之間的轉換減少(P<0.05),睡眠維持穩(wěn)定。12 h白天除S-W之間的轉換以及12 h夜間所有時相之間的轉換比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

    A:各組大鼠白天各睡眠覺醒時相之間的轉換次數(shù);B:各組大鼠夜間各睡眠覺醒時相之間的轉換次數(shù)。

    2.6 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平變化比較 見表2。 電針后,與對照組比較,模型組和假電針組大鼠血清FSH、LH水平升高(P<0.01)、E2水平降低(P<0.01),電針組大鼠血清FSH升高(P<0.05)、E2水平降低(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠血清FSH、LH水平降低(P<0.05)、E2水平升高(P<0.05)。

    表2 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平變化比較

    3 討 論

    睡眠是一種高度保守的生命現(xiàn)象,與生物進化、物種繁衍和個體生存發(fā)展等密切相關。失眠等睡眠問題是婦女圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后的主要主訴,隨著人們對身心健康的逐漸重視,門診中睡眠問題患者越來越多,女性步入絕經(jīng)期后逐漸出現(xiàn)失眠并進展為慢性失眠,嚴重影響患者的社會功能。該階段是女性一生所必須經(jīng)歷的生理過程,卵巢功能一旦衰竭或被切除和破壞,卵巢分泌的雌激素就會減少。隨著社會的發(fā)展,人們精神壓力增加,卵巢早衰的情況也在增加,睡眠覺醒障礙發(fā)病率升高,失眠即成為圍絕經(jīng)期女性最常見的主訴之一[23-24]。

    PMI的發(fā)病因素多樣,且相互關聯(lián)。此時若不及時醫(yī)治,可導致圍絕經(jīng)期時間延長,患老年病幾率增高,工作效率降低,生活質量下降,并增加家庭矛盾,破壞家庭關系。長期失眠不僅會對患者的正?;顒赢a(chǎn)生很大影響,而且還會降低患者的生理功能并引起一系列并發(fā)癥[25-26]。與睡眠好的絕經(jīng)婦女比較,睡眠差的絕經(jīng)婦女更容易伴發(fā)慢性疾病以及更差的健康狀況,因此有必要為絕經(jīng)相關失眠癥提供有效的療法。提高圍絕經(jīng)期女性生活質量,讓每個圍絕經(jīng)期女性都可以安心健康地過渡到下一個人生階段,非常重要。

    中醫(yī)學中并無“圍絕經(jīng)期失眠”的專屬名詞,但依據(jù)其主要發(fā)病時間和臨床特點,可將之歸屬于“經(jīng)斷前后諸證”“不寐”等范疇。圍絕經(jīng)期失眠因其所處的特殊生理階段,因此與普通失眠又有不同,與“臟躁”“百合病”“郁病”相關?!秲?nèi)經(jīng)·上古天真論》曰:“七七,任脈虛,太沖脈衰,天癸竭,地道不通,故形壞而無子”,該階段女性天癸將竭,腎氣漸衰,沖任空虛虧損,導致臟腑失于濡養(yǎng),陰陽失于平衡而失眠。同時,圍絕經(jīng)期失眠,存在精血虧虛、陰血不足的基本病機,而在此基礎上出現(xiàn)心神受擾,神魂不安。綜合圍絕經(jīng)期女性的生理特點,極易發(fā)生失眠。

    激素替代療法、催眠藥和精神藥物一直用于圍絕經(jīng)期失眠患者的治療,但這些藥物都有嚴重的不良反應[27]。失眠的認知行為療法和睡眠限制療法已開始用于PMI的治療,但臨床運用比較局限。課題組之前評估了針灸治療PMI患者的短期療效[28],研究表明針刺可以明顯降低PMI患者失眠嚴重程度(ISI)評分、匹茲堡睡眠質量指數(shù)(PSQI)評分,顯著提升睡眠效率和夜晚整體睡眠時間,并顯著降低夜間覺醒時間,尤其可以減少患者淺睡眠時間,針灸在主觀和客觀上促進PMI的臨床相關改善。另有研究評估了電針對PMI患者睡眠和生活質量短期和長期的影響[29],結果證實電針治療優(yōu)于假電針治療,是一種更安全、更有效的治療方法,可以改善絕經(jīng)后患者的睡眠質量,并具有長期的療效和出色的安全性。

    女性進入圍絕經(jīng)期前后,體內(nèi)的卵巢激素也會發(fā)生相應的變化,在此階段,卵巢體積變小,卵泡發(fā)育欠佳,雌激素水平降低、孕酮分泌含量生理性地減少,卵巢激素的波動而對睡眠產(chǎn)生影響[30]。本研究采用ELISA法測定大鼠血清FSH、LH、E2水平的變化情況,與對照組比較,模型組大鼠陰道脫落細胞顯示動情周期紊亂或消失,血清FSH、LH水平升高、E2水平降低。與模型組比較,電針組大鼠血清FSH、LH水平降低、E2水平升高。說明電針可以調節(jié)PMI大鼠血清性激素水平,調節(jié)體內(nèi)卵巢激素水平的變化。

    實驗研究發(fā)現(xiàn),去卵巢小鼠不能有效維持覺醒,活動期睡眠量增加,表現(xiàn)出類似絕經(jīng)期白天嗜睡樣睡眠障礙[18]。電針可影響PMI大鼠睡眠時相,延長REMS、SWS1 時間[17],能增加去卵巢大鼠NREM睡眠時間,減少覺醒時間,改善去卵巢大鼠的睡眠覺醒狀態(tài)[31]。腦電記錄是睡眠研究的必要手段,本實驗研究了電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒腦電圖的改變,通過對大鼠睡眠覺醒時程、睡眠覺醒累積量、不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)、睡眠覺醒時相轉換次數(shù)的分析,說明了電針對PMI大鼠睡眠覺醒量、睡眠結構的改善。研究發(fā)現(xiàn):模型組大鼠24 h睡眠覺醒時程在白天的覺醒增多、NREMs減少,白天和夜間短時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)增多、長時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)減少,白天睡眠到覺醒之間的轉換增多。嚙齒類大鼠為夜行動物,睡眠問題發(fā)生在白天與人類夜間睡眠相符。電針治療后,電針組大鼠白天的覺醒減少、NREMs增多,白天和夜間短時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)減少、長時程增多,白天睡眠到覺醒之間的轉換減少。說明電針可以改善圍絕經(jīng)期失眠大鼠的睡眠覺醒狀態(tài),減少覺醒量,增加睡眠量,對于睡眠結構有顯著影響,可提升睡眠的質量,保持睡眠維持能力和穩(wěn)定性。

    綜上所述,電針對PMI大鼠睡眠覺醒腦電圖具有積極的改善作用,可減少覺醒時間,增加睡眠時間,改善其睡眠結構,提升睡眠質量,我們認為電針可以作為治療PMI或卵巢早衰的臨床手段,其機制可能與血清性激素水平有關。

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