高效液相色譜法測(cè)定中果酒中山梨酸含量的不確定度評(píng)定

在防腐保鮮劑中，山梨酸具有高效性和安全性，這是得到國際社會(huì)共同認(rèn)可的[1]。其作用機(jī)理是通過降低食品中微生物脫氫酶的活性抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，廣泛應(yīng)用于多種行業(yè)[2]。因此，對(duì)食品中的山梨酸的定性和定量檢測(cè)在保障食品安全方面至關(guān)重要[3-5]。本研究采用GB 5009.28—2016方法測(cè)定果酒中山梨酸的含量，并依據(jù)JJF 1059.1—2012對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中各分量所產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行評(píng)估計(jì)算。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果酒來自食品安全監(jiān)督隨機(jī)抽樣樣本；乙酸銨：致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司（天津）；甲醇：Merck公司（德國）；水中山梨酸（1.00 mg·mL-1）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 3D高效液相色譜儀：日本島津；MS205DU電子天平：瑞士Mettler-Toledo。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約2 g果酒于50 mL容量瓶中，用純化水定容至刻度，混勻，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，按照液相色譜儀操作進(jìn)樣測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確量取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mL于10 mL容量瓶，用水定容至刻度得到500 μg·mL-1的中間儲(chǔ)備液。精密吸取山梨酸中間溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于10 mL容量瓶，用超純水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

果酒中山梨酸含量測(cè)定：樣液由液相色譜儀進(jìn)行峰面積測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到果酒中山梨酸的質(zhì)量濃度。

1.3.2 建立數(shù)學(xué)模型

按照以上試驗(yàn)操作，建立果酒中山梨酸的含量不確定度數(shù)學(xué)模型為

式中：X為果酒中山梨酸含量，g·kg-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出果酒待測(cè)樣液的濃度，μg·mL-1；V為稀釋后的試樣體積；m為果酒質(zhì)量，g；1 000為單位換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定不確定度的來源

從樣品前處理、液相色譜測(cè)定以及數(shù)學(xué)模型可知，測(cè)定果酒中山梨酸含量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液引入urel(std)、校準(zhǔn)曲線建立引入urel(S)、實(shí)驗(yàn)前處理引入urel(P)和樣品重復(fù)性測(cè)量引入urel(R)。

2.2 不確定度分量因素的量化計(jì)算

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度urel(std)

本實(shí)驗(yàn)采用的標(biāo)準(zhǔn)品為水中山梨酸，濃度為1.00 mg·mL-1，擴(kuò)展不確定度為±1%（k=2）。則山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度為

2.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和建立校正曲線引入的相對(duì)不確定度urel(S)

（1）由配制標(biāo)準(zhǔn)中間工作液引入的不確定度urel(S1)。①5 mL刻度吸管引入的相對(duì)不確定度urel(S1-1)。規(guī)定5 mL刻度吸管（A級(jí)）容量允差為±0.025 mL，采用B類評(píng)定方法，取矩形分布，則

②定容至10 mL容量瓶引入的相對(duì)不確定度urel(S1-2)。則

③溫度變化引入的相對(duì)不確定度urel(S1-3)。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20 ℃±5 ℃，此溫度下玻璃膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。取均勻分布計(jì)算

合并以上分量相對(duì)不確定度，則由配制中間標(biāo)準(zhǔn)溶液過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度urel(S2)。吸取標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于10 mL容量瓶中，引入的不確定度如下。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線使用了0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL刻度吸管，依照相關(guān)規(guī)程JJG 196—2006、JJG 646—2006規(guī)定，按均勻分布并取矩形分布，采取B類評(píng)定方法，則由刻度吸管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2-1)為

吸取的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液定容于10 mL容量瓶，引入的不確定度主要是容量瓶定容引入u(S2-2)和溫度變化引入u(S2-3)。依照相關(guān)規(guī)程JJG 646—2006和JJG 196—2006的規(guī)定，10 mL容量瓶最大允差±0.020 mL，按照B類評(píng)定方法，取矩形分布，則按照均勻分布計(jì)算，則

合并以上分量相對(duì)不確定度，則由標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對(duì)不確定度為

（3）建立校準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(S3)。5個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的峰面積見表1，結(jié)合校準(zhǔn)曲線為y=a+bx和最小二乘法擬合，得出a=-1 599.87，b=60 292.79，在下列各式中視為常數(shù)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品測(cè)得結(jié)果表

根據(jù)公式（2）、（3）計(jì)算校準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(S3)為

式中：xpredi為測(cè)定山梨酸含量引入的不確定度；S為由擬合直線求得與相應(yīng)yi測(cè)定值之差按貝塞爾公式求出的殘余標(biāo)準(zhǔn)誤差；p為樣品溶液測(cè)定次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)；為山梨酸濃度平均值，μg·mL-1；為山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值，μg·mL-1。

將表1中各數(shù)據(jù)代入公式（2）、（3），計(jì)算得S=13 483.51，u(S3)=0.144 μg·mL-1，則校準(zhǔn)曲線引入的不確定度為

合并以上分量，由建立標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度為

2.2.3 試樣前處理引入的不確定度urel(P)

（1）試樣稱樣引入的不確定度urel(P1)。稱量樣品使用的天平（MS205DU），不確定度為U=0.02 mg，k=2，由此引入的不確定度為u(P1)=0.000 02/2=1.000×10-5g；由稱取果酒樣品為2.000 g引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P1)=u(P1)/2.000=5×10-6。

（2）由定容體積引入的不確定度urel(P2)。樣品處理后用50 mL的A級(jí)容量瓶定容，參照《常用玻璃量具檢定規(guī)程》，其最大允許誤±0.05 mL，采用B類評(píng)定方式，考慮由矩形分布引入的不確定度為則定容的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P2)=u(P2)/50=5.78×10-4。

（3）溫度變化引入的樣品定容不確定度urel(P3)。根據(jù)均勻分布則50 mL容量瓶的溫度波動(dòng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(P3)=50×(2.1×10-4-2.5×10-5)×則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P3)=u(P3)/50=5.34×10-4。

合并以上分量，由試樣前處理引入的不確定度為

2.2.4 試樣測(cè)定結(jié)果重復(fù)性的不確定度urel(R)

本實(shí)驗(yàn)考察了儀器測(cè)試穩(wěn)定性，對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)量5次，所得結(jié)果分別為 0.515 0 g·kg-1、0.515 0 g·kg-1、0.510 3 g·kg-1、0.512 9 g·kg-1和 0.517 7 g·kg-1。采用 A類評(píng)定，應(yīng)用貝塞爾法計(jì)算，則重復(fù)測(cè)量同一樣品量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 擴(kuò)展不確定度計(jì)算（U）及結(jié)果報(bào)告

綜合以上結(jié)果，根據(jù)影響本測(cè)定實(shí)驗(yàn)不確定度urel(std)、urel(S)、urel(P)、urel(R)的各分量合成計(jì)算，得出果酒中山梨酸含量測(cè)定的相對(duì)不確定度urel(T)為

試樣中山梨酸含量的算術(shù)平均值為0.514 0 g·kg-1，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(t)=urel(T)×0.514 0=0.010 4 g·kg-1。

取包含因子k=2得出擴(kuò)展不確定度為

因此，在置信概率P=95%（k=2）時(shí)，本實(shí)驗(yàn)果酒中山梨酸含量的測(cè)定不確定報(bào)告為X=(0.514 0±0.020 8) g·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本研究對(duì)高效液相色譜法測(cè)定果酒中山梨酸所引入的不確定度各分量進(jìn)行分析和合成，結(jié)論得出配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度貢獻(xiàn)率最大（87.7%）。針對(duì)以上數(shù)據(jù)，為有效提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，關(guān)鍵控制點(diǎn)在于減少建立校正曲線時(shí)配制系列工作曲線引入的誤差，所以需要減少小體積的移取偏差，可以通過將刻度吸管換為更精準(zhǔn)的進(jìn)口移液器，減小允差，同時(shí)使用高精度的量具來減小引入的不確定度，定期維護(hù)和檢定移液槍和量具。此數(shù)學(xué)模型可為其他液相色譜測(cè)定酒類添加劑不確定度研究提供參考。