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    面粉中霉菌和酵母計數(shù)能力驗證結(jié)果分析

    2022-10-20 09:06:18仇平平
    現(xiàn)代食品 2022年17期
    關(guān)鍵詞:霉菌酵母無菌

    能力驗證(Proficiency Testing)是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構(gòu)檢測能力的活動,是檢驗實驗室檢測水平的一項重要手段。實驗室通過參加能力驗證活動,不僅可以清楚了解本機構(gòu)實驗室的檢測能力和水平,考察檢驗人員的技術(shù)水平和設(shè)備的性能,還可以從外部尋找與同行之間的差異,發(fā)現(xiàn)自身存在的不足,及時有效地提出改進(jìn)措施,持續(xù)改進(jìn)和完善實驗室的質(zhì)量控制和管理[1-2]。

    霉菌和酵母屬于真菌,在食物中繁殖速度非??欤瑫a(chǎn)生大量的毒素,對人體造成致命性的危害。例如,黃曲霉毒素就是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素,黃曲霉毒素已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)劃定為一類天然存在的致癌物[3]?;ㄉ?、花生油、玉米等食品中極易受到黃曲霉毒素的污染。同時,霉菌和酵母也是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌,已成為食品中常規(guī)的檢測項目之一[4]。目前,《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》(GB 4789.15—2016)是普遍采用的霉菌和酵母檢驗方法,該方法操作簡單,但由于霉菌和酵母自身繁殖特點,前期生長緩慢,后期急劇生長,蔓延生長甚至連片,導(dǎo)致計數(shù)時比較困難,因此霉菌和酵母計數(shù)也是考察實驗室和檢測人員技術(shù)水平的重要參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品

    本次能力驗證樣品由中國食品藥品檢定研究院提供,2份待測樣品,每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶(規(guī)格:1粒/瓶)和相同編碼的面粉1袋(規(guī)格:25 g/袋),2份樣品的編號分別為TF03280014和TF03280027。

    1.2 培養(yǎng)基及試劑

    孟加拉紅瓊脂,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;0.85%無菌生理鹽水,北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

    1.3 儀器設(shè)備

    無菌均質(zhì)器S-154,上海德記行科技發(fā)展公司;MJ-250BSH-Ⅲ型霉菌培養(yǎng)箱S-01,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 樣品處理

    在生物安全柜內(nèi)打開裝有霉菌和酵母菌球的西林瓶,并將霉菌和酵母菌球加入到盛225 mL 0.85%無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,充分均質(zhì)混勻。再將與西林瓶相同編碼的面粉基質(zhì)加入到上述生理鹽水中,充分均質(zhì)混勻,作為1∶10的樣品勻液。

    1.4.2 樣品稀釋

    (1)吸取1∶10樣品勻液1 mL,加入到盛有9 mL無菌生理鹽水的無菌試管中,混勻,制成1∶100的樣品勻液,依此法繼續(xù)用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,制備1∶1 000的樣品勻液。

    (2)分別吸取各稀釋級的樣品勻液1 mL于無菌平皿內(nèi),每個稀釋級做2個平皿。同時,分別取1 mL 0.85%無菌生理鹽水加入到兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時將20~25 mL冷卻至46 ℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿,并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻,置水平臺面待培養(yǎng)基完全凝固。

    (3)培養(yǎng)。將上述凝固后培養(yǎng)基,正置平板,放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第5天,逐日觀察并記錄結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同取樣方式下霉菌和酵母的計數(shù)結(jié)果

    面粉一般指小麥粉,即由小麥磨成的粉狀物。面粉主要成分是淀粉,是不溶于水的,會形成懸濁液[5],面粉在0.85%的無菌生理鹽水中也不能完全溶解,會形成懸濁液,放置1~2 min面粉會下沉至底部,所以取樣方式對檢測結(jié)果會有一定影響。本實驗設(shè)計兩種取樣方式。第一種是用無菌均質(zhì)器均質(zhì)1 min混勻后直接取懸濁液進(jìn)行后續(xù)檢測,第二種是用無菌均質(zhì)器均質(zhì)1 min混勻后放置1~2 min取上清液進(jìn)行后續(xù)檢測。從計數(shù)結(jié)果來看,第二種取樣方式霉菌和酵母數(shù)均比第一種取樣方式多,詳見表1、表2。本實驗選取第二種取樣方式(上清液)的結(jié)果報數(shù),TF03280014的Z值為1.68,TF03280027的Z值為0.66,兩份樣品|Z|值均小于2.0,|Z|值≤2為滿意結(jié)果,故兩份樣品結(jié)果均為滿意。

    表1 TF03280014霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果表

    表2 TF03280027霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果表

    2.2 孟加拉紅培養(yǎng)基上霉菌和酵母生長形態(tài)變化

    孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中的氯霉素可抑制細(xì)菌的生長,孟加拉紅是一種選擇性抑菌劑,也可抑制細(xì)菌的生長,并減緩某些霉菌菌落的蔓延生長。孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基可選擇性地抑制細(xì)菌生長而不影響霉菌和酵母的生長,排除細(xì)菌生長帶來的干擾。

    在孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)霉菌和酵母,到第2天才開始有菌落生長,以10-1稀釋級霉菌和酵母培養(yǎng)第2~5天的生長形態(tài)為例來描述霉菌和酵母生長趨勢,見圖1。霉菌和酵母均在培養(yǎng)至第2天時可以看到明顯的菌落,第3~5天霉菌迅速生長,酵母相對比較小,霉菌菌絲蔓延成片。對于霉菌而言培養(yǎng)至第3天的時候菌落已出現(xiàn)連片現(xiàn)象,從正面不易計數(shù),從背面可以清晰看見菌核,易于計數(shù)。實驗中發(fā)現(xiàn)在菌落數(shù)比較少的稀釋級平板上(如10-2稀釋級),培養(yǎng)至第2天到第5天的菌落數(shù)基本沒有變化。

    綜合以上描述,觀察結(jié)果應(yīng)逐天進(jìn)行,尤其是培養(yǎng)2~3 d時,霉菌計數(shù)比較關(guān)鍵。酵母相對于霉菌菌落較小,菌落形態(tài)清晰,易于計數(shù)。

    圖1 TF03280014霉菌和酵母10-1級兩個平行平皿培養(yǎng)后的菌落形態(tài)變化圖

    3 結(jié)論與討論

    3.1 影響計數(shù)的關(guān)鍵因素

    3.1.1 取樣方式

    本次能力驗證設(shè)計了兩種取樣方式來考察霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果。第二種取樣方式(取上清液開展后續(xù)試驗)比第一種取樣方式(取懸濁液開展后續(xù)試驗)計數(shù)結(jié)果偏多,分析原因有兩個方面。①經(jīng)過均質(zhì)的樣品勻液可認(rèn)為是菌株均勻分布于0.85%的生理鹽水中,放置一會兒面粉顆粒會下沉至底部,此時分別吸取1 mL樣品懸濁液和上清液,懸濁液中的面粉顆粒會占據(jù)一部分的體積,上清液中面粉顆粒相對較少菌含量相對較高。②面粉顆粒在后續(xù)觀察時會影響視線,容易少計數(shù),所以本實驗選擇取上清液的結(jié)果報數(shù)。

    3.1.2 計數(shù)方法

    (1)培養(yǎng)時間。實驗觀察發(fā)現(xiàn)霉菌和酵母從培養(yǎng)至第2天開始計數(shù),此后霉菌生長速度很快,至第4天菌絲布滿整個平板,霉菌和酵母相互覆蓋影響準(zhǔn)確計數(shù)。培養(yǎng)至第5天時,從正面無法計數(shù),只能從背面計數(shù)(圖2)。此時計數(shù)相對來說誤差會比較大。同時霉菌會產(chǎn)生菌絲,在觀察結(jié)果的過程移動平板,會造成菌絲飄散,形成次生菌。

    圖2 TF03280014培養(yǎng)至第5天霉菌和酵母的菌落形態(tài)圖

    (2)菌落形態(tài)。每份樣品中都有霉菌和酵母,霉菌生長速度快,后期逐漸形成褶皺,第4天、第5天霉菌布滿整個平板,此時霉菌從正面難以計數(shù),從背面計數(shù)霉菌主要以菌核計算(如圖2),但是有些菌核不明顯,此時能不能記為單獨菌落又因人而異(如圖3中B處)。霉菌培養(yǎng)至第4天時就產(chǎn)生明顯的褶皺,從背面看像是兩個菌核(如圖3中A處),容易計成兩個菌落。部分酵母長在培養(yǎng)基內(nèi)部,部分長在培養(yǎng)基表面,霉菌蔓延至整個平皿的時候掩蓋住部分酵母,正面難以準(zhǔn)確計數(shù),而從背面計數(shù)時因酵母有大有小,小的菌落與面粉顆粒容易混淆,菌落計數(shù)存在誤差(如圖4標(biāo)識圓圈內(nèi))。

    圖3 TF03280027 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養(yǎng)至第4天的形態(tài)(背面觀察)圖

    圖4 TF03280014 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養(yǎng)至第4天的形態(tài)(背面觀察)圖

    3.2 能力驗證中關(guān)鍵控制點

    3.2.1 人員

    檢測人員是影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性和真實性至關(guān)重要的因素。食品微生物檢測人員需具備食品微生物檢測的專業(yè)知識,并有相關(guān)的實習(xí)經(jīng)驗或工作經(jīng)驗,檢測人員需通過食品微生物檢測相關(guān)理論知識和實操技能考試,取得上崗證后方可上崗。檢測人員實驗操作熟練度和規(guī)范性直接影響實驗結(jié)果,檢測人員可每年參加專業(yè)機構(gòu)組織的“生物安全”“食品微生物檢測理論和實操”等主題的培訓(xùn)班來提高自身理論知識和檢驗水平,不斷積累總結(jié)好的經(jīng)驗,優(yōu)化自身知識結(jié)構(gòu),提升自身綜合素質(zhì)。實驗室可結(jié)合日常工作情況、外部審核、能力驗證等對檢驗人員定期開展監(jiān)控。對于特殊情況,如新項目、新設(shè)備、新人員上崗、投訴和結(jié)果偏離等情況應(yīng)隨時開展監(jiān)控[6]。

    3.2.2 實驗條件

    實驗室應(yīng)配備滿足檢驗要求的儀器設(shè)備,設(shè)備應(yīng)檢定合格,使用之前應(yīng)做好確認(rèn),并定期做期間核查;實驗室應(yīng)配備符合要求的培養(yǎng)基及試劑,培養(yǎng)基應(yīng)驗收合格,使用之前應(yīng)完成質(zhì)量控制,因孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基見光易分解,配制好的培養(yǎng)基可應(yīng)避光放置,培養(yǎng)基最好現(xiàn)用現(xiàn)配,不要放置于冰箱中過夜保存。

    3.2.3 實驗方法

    確認(rèn)樣品完好無誤后,檢測人員應(yīng)認(rèn)真閱讀相關(guān)能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書,嚴(yán)格按要求處理樣品,在轉(zhuǎn)移西林瓶里的菌球時,應(yīng)注意看菌球是否有散落,可用稀釋液反復(fù)沖洗西林瓶,保證目標(biāo)菌盡可能完全轉(zhuǎn)移,目標(biāo)菌的轉(zhuǎn)移對后續(xù)菌落計數(shù)至關(guān)重要。后續(xù)檢測應(yīng)嚴(yán)格按照GB 4789.15—2016要求進(jìn)行,操作要規(guī)范。微量移液器卡緊槍頭,防止漏液,保持豎直,在轉(zhuǎn)移過程中不要碰到試管內(nèi)側(cè);每次稀釋要充分混勻,操作過程要規(guī)范,防止樣液噴濺;培養(yǎng)基溫度需冷卻至46 ℃,加入培養(yǎng)基后需立即轉(zhuǎn)動平皿混勻,力度不要過大,防止培養(yǎng)基濺出。

    3.2.4 結(jié)果計數(shù)

    在本次能力驗證中發(fā)現(xiàn),霉菌和酵母一般在48 h以后開始生長,所以本文建議從培養(yǎng)至第2 天開始計數(shù),計數(shù)過程中注意輕拿輕放平,勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板,防止霉菌菌絲飄散形成次生菌。霉菌后期生長速度很快,菌絲蔓延,計數(shù)比較困難,霉菌在培養(yǎng)至第3天、第4天和第5天時菌落數(shù)基本一致,本文建議霉菌計數(shù)可密切關(guān)注培養(yǎng)至第3天的結(jié)果,酵母計數(shù)可重點關(guān)注培養(yǎng)至第4天、第5天的結(jié)果。

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