液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米中伏馬毒素的不確定度評(píng)定

伏馬毒素是鐮刀菌在環(huán)境條件影響下產(chǎn)生的水溶性有毒次級(jí)代謝物，已發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有30多種，包括FB1、FB2、FB3等，毒性最大的是FB1[1]。玉米在種植、收獲、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等過(guò)程易發(fā)生伏馬毒素感染現(xiàn)象。范楷等[2]對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FB1、FB2、FB3的檢出率為49.0%、35.7%、29.3%。伏馬毒素污染的糧食進(jìn)入食物鏈后，會(huì)對(duì)人的身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3]。許多國(guó)家和組織制定了食品中多種伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]。我國(guó)食品中伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)還未正式頒布，因而對(duì)伏馬毒素的研究具有重要意義[5]。本研究實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法基于同位素稀釋的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠快速提取伏馬毒素，提取效率和靈敏度高。

檢測(cè)方法的測(cè)量不確定度是對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的評(píng)估，受到各類實(shí)驗(yàn)室的廣泛重視[6]。測(cè)量不確定度是指由于測(cè)量誤差的存在，對(duì)被測(cè)量值不能確定的程度，其對(duì)于評(píng)判檢測(cè)方法的科學(xué)性及準(zhǔn)確性具有重要意義[7]。有研究基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)玉米粉中伏馬毒素B1的不確定度評(píng)定，但檢測(cè)方法缺少FB2和FB3，因此不確定度的評(píng)定不夠完全。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的評(píng)估方法和程序，對(duì)同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米中FB1、FB2、FB3進(jìn)行不確定度的評(píng)定，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用玉米樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；甲醇、乙腈，色譜純，sigma公司；甲酸，色譜純，霍尼韋爾公司；甲酸98%，國(guó)藥化學(xué)試劑公司；伏馬毒素B1（50 μg·mL-1）、伏馬毒素 B2（50 μg·mL-1）、伏馬毒素B3（50 μg·mL-1）、13C伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液（U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2，均為 5 μg·mL-1）、13C 伏馬毒素B3(U-[13C34]-FB3，10.02 μg·mL-1），Romer公司。

LC-30AD高效液相色譜儀，島津公司；AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀，AB Sciex公司；Allegra 64R臺(tái)式高速離心機(jī)，貝克曼公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，同泰聯(lián)公司；Mili-Q超純水機(jī)，Millipore公司；Dragon Lab QL902渦旋振蕩器，Dragon Lab公司；SB-3200DTDN超聲波清洗器，新芝生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法及儀器條件均為實(shí)驗(yàn)室自建，符合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別移取伏馬毒素儲(chǔ)備液 100 μL加 900 μL乙腈∶水（80∶ 20，V/V）稀釋成5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液；分別移取40 μL伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水（80∶20，V/V）溶液定容，配制成質(zhì)量濃度均為40 μg·L-1的混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，利用逐級(jí)稀釋的方法，用流動(dòng)相稀釋得到一系列濃度為2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和80 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（2）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別移取40 μL（U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2）伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液和20 μL U-[13C34]-FB3溶液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水（80∶20，V/V）溶液，配制成質(zhì)量濃度為40 μg·L-1穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品（精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入50 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液渦旋1 min，再加入10 mL乙腈∶水∶甲酸（80∶18∶2，V∶V∶V）溶液，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min；在 4 ℃下 8 000 r·min-1離心 10 min；取 5 mL 上清液在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲醇∶水∶甲酸（30∶70∶0.1，V∶V∶V）溶液，渦旋振蕩1 min，超聲 5 min，12 000 r·min-1離心 10 min，取上層清液上機(jī)待測(cè)。

1.2.3 儀器條件

（1）液相條件。色譜柱：Shiseido-C18（100 mm×2.0 mm×3 μm）；進(jìn)樣體積為 10 μL；流速 0.3 mL·min-1；流動(dòng)相A：0.1%甲酸/水溶液，流動(dòng)相B；甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～1 min 30% B，1.0～6.5 min 30%→55% B，6.5～8.5 min 55% B，8.5～10.0 min 55%→80% B，10～12 min 80% B，12.0～12.1 min 80%→30% B，12.1～16.0 min 30% B。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V（正模式）；氣簾氣：35 psi；氣體1：50 psi；氣體2：55 psi；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件參數(shù)表

1.2.4 含量計(jì)算

伏馬毒素含量計(jì)算公式為

式中：Xi為樣品中伏馬毒素的含量，μg·kg-1；Ci為從標(biāo)準(zhǔn)曲線所得測(cè)定液中伏馬毒素的濃度，μg·L-1；V為試樣的定容體積，mL；m為試樣的稱樣量，g；D為稀釋倍數(shù)，D=2；為回收率校正因子。

2 結(jié)果與分析

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)量不確定度的來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、前處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度

伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度表

2.1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度

將 50 μg·mL-1伏 馬 毒 素 混 合 儲(chǔ) 備 液 稀 釋 到5 μg·mL-1。依據(jù)檢定規(guī)程，配制過(guò)程中使用5 mL單標(biāo)線容量瓶2次（矩形分布）；5 mL移液槍3次，1 mL移液槍3次，100 μL移液槍6次（三角分布），引入的不確定度見(jiàn)表3。

由于同位素內(nèi)標(biāo)濃度不參與結(jié)果計(jì)算。因此，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表3 使用器具引入的不確定度表

2.1.3 溫度引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±5）℃。標(biāo)準(zhǔn)中間工作液用乙腈定容，室溫20 ℃其膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃。依據(jù)矩形分布，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 前處理引入的不確定度

2.2.1 稱量引入的不確定度

天平校準(zhǔn)鑒定證書給定誤差0.5 mg，準(zhǔn)確稱量2.00 g時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 量取提取液引入的不確定度

樣品提取時(shí)，使用10 mL移液槍準(zhǔn)確量取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2溶液，根據(jù)校準(zhǔn)證書，20 ℃時(shí)允差為0.14%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度（三角分布）為樣品提取后，5 mL移液槍量取5 mL上清液氮吹，20 ℃時(shí)允差為0.15%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度（三角分布）為則量取提取液時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

配制濃度為 2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和 80 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性相關(guān)系數(shù)r2由最小二乘法線性擬合得到，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線表

擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量標(biāo)準(zhǔn)。儀器測(cè)量值與理論計(jì)算值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

標(biāo)準(zhǔn)溶液殘差平方和為

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線Y與相應(yīng)Yi的回歸剩余標(biāo)準(zhǔn)差；p為樣品溶液測(cè)定總次數(shù)，p=6；m為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定總次數(shù)，m=6；a為回歸系數(shù)；X為樣品中含伏馬毒素含量，μg·L-1；c-為標(biāo)準(zhǔn)溶液中伏馬毒素平均值，μg·L-1；ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液中伏馬毒素量，μg·L-1；yi為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積；y為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的回歸值；b為回歸系數(shù)。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度結(jié)果表

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

表6 樣品重復(fù)測(cè)定檢測(cè)及不確定度結(jié)果表

2.5 加標(biāo)回收引入的不確定度

空白玉米樣品加入4 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)回收引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為對(duì)平均加標(biāo)回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，確定平均加標(biāo)回收率與期望值1是否存在顯著性差異，并用t檢驗(yàn)表示。自由度f(wàn)=n-1=5，查t值臨界值分布表，t值均大于雙側(cè)臨界值t(0.05,5)=2.571，表示結(jié)果存在顯著性差異，用回收率校正因子修正。伏馬毒素的回收率和不確定度結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 伏馬毒素的回收率和不確定度結(jié)果表

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度與擴(kuò)展不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

根據(jù)JJF 1059.1—2012，置信水平為95%時(shí)，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為U(X)=k×X×urel(X)，3種伏馬毒素的擴(kuò)展不確定度及檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 伏馬毒素的檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)綜合考慮各因素，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度最小，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度最大。因此在實(shí)驗(yàn)中，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)需遵守操作步驟，移液槍、液相色譜、質(zhì)譜等設(shè)備進(jìn)行定期維護(hù)檢修，保持高靈敏度，定期檢定校準(zhǔn)，提高準(zhǔn)確性。