高效液相色譜法測(cè)定人血漿中萬古霉素濃度

陳金成 張 吟林麗梅 王培紅

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，福建泉州 362000

萬古霉素，一種糖肽類時(shí)間依賴性抗生素，其藥物代謝動(dòng)力學(xué)/藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)參數(shù)為藥時(shí)曲線下面積/最低抑菌濃度（area under curve/minimum inhibitory concentration，AUC/MIC），其治療窗較窄，且其藥理作用和不良反應(yīng)在一定程度上與其血藥濃度相關(guān)，較低的濃度容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，過高濃度又會(huì)引起耳、腎毒性，影響萬古霉素血藥濃度的因素有很多。神經(jīng)外科術(shù)后患者合并使用甘露醇、利尿劑、氨基糖苷類抗生素等腎損害藥物的概率較高，尤其ICU患者，需要進(jìn)行萬古霉素血藥濃度檢測(cè)的人群數(shù)量較多，而萬古霉素血藥濃度檢測(cè)能顯著降低耳腎毒性的發(fā)生率，因此，臨床上為保證藥物安全和有效對(duì)萬古霉素患者進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)就顯得十分必要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-30AD，日本島津）；CTO-30A進(jìn)樣器（LC-30AD，日本島津）；SPD-M20A紫外檢測(cè)器（LC-30AD，日本島津）；SHB-DIII循環(huán)水真空泵（上海申光儀器儀表有限公司）；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XH-B漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；800臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；離心機(jī)（2-5k，德國Sigma公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-Qacademic，美國Millipore公司）；分析電子天平（瑞士，梅特勒公司）。

1.2 試藥

萬古霉素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130360-201302）；內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：30338-200303）；空白血漿（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心，健康體檢者的混合血漿）；乙腈（HPLC級(jí)，批號(hào)：MS1922-001，美國TEDIA公司）；磷酸二氫鉀（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150407）；硫酸鋅（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150104）；以上試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C100 mm×4.6 mm，2.6 μm；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（pH3.2）的梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長：220 nm；進(jìn)樣量：10 μl。采用梯度洗脫法，洗脫程序?yàn)闀r(shí)間0.01、3.00、9.25、9.50、13.5、13.75、18.00 min時(shí)，分別對(duì)應(yīng)的B相百分比為3%、8%、8%、60%、60%、3%及停止。

2.2 溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)品萬古霉素溶液：精密稱取萬古霉素10 mg 于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的萬古霉素溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素溶液：精密稱取去甲萬古霉素10 mg于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

10%硫酸鋅溶液：精密稱取硫酸鋅1 g加超純水溶解并于10 ml容量瓶中定容，配制成10%硫酸鋅溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品前處理

將配置好的萬古霉素溶液用超純水分步稀釋，分別配置成20、50、100、200、500、1000 μg/ml的萬古霉素溶液。取空白血漿180 μl，依次加入上述濃度的萬古霉素溶液20 μl及內(nèi)標(biāo)（去甲萬古霉素溶液）20 μl，再加入10%硫酸鋅溶液50 μl，漩渦震蕩30 s，離心（轉(zhuǎn)速：10 900 r/min，半徑：10 cm）10 min，取上清液進(jìn)樣。結(jié)果見圖1~4，計(jì)算萬古霉素濃度，萬古霉素峰保留時(shí)間8 min左右，并且與前后峰分離度良好，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 去甲萬古霉素純樣色譜圖

圖3 萬古霉素純樣色譜圖

圖4 給藥患者血漿樣品+內(nèi)標(biāo)色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

上述萬古霉素溶液加入空白血漿后，依次配制成2.22、5.56、11.11、22.22、55.56、111.11 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血樣，進(jìn)樣后以萬古霉素與去甲萬古霉素濃度之比為橫坐標(biāo)X，以萬古霉素與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，做線性回歸，即得直線方程Y=1.33X+0.0056，R= 0.9997（圖5）。

圖5 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 最低定量下限

取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低濃度2.22 μg/ml的溶液，用空白血漿進(jìn)行稀釋，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，在定量下限濃度為2.22 μg/ml濃度下，信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=13.7，符合靈敏度要求。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度考察

取線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）的萬古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)液。按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，1天之內(nèi)平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，包括回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。取相同樣品連續(xù)測(cè)5 d，期間于4℃冰箱保存，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1，符合方法學(xué)要求。

表1 萬古霉素日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度（n=5，%）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備低、中、高3種濃度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）萬古霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，分別在室溫放置4 h、室溫放置24 h、反復(fù)凍融1次、反復(fù)凍融2次的條件下考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表2，在上述條件下萬古霉素穩(wěn)定性良好。

表2 萬古霉素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（n=5）

2.8 臨床應(yīng)用

患者男，42歲，因腦干出血入福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU，后一般細(xì)菌涂片檢查出革蘭陽性球菌與革蘭陰性桿菌，以萬古霉素以1.0 g，q12 h靜脈滴注進(jìn)行抗感染治療，穩(wěn)態(tài)后抽血進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果為20.48 μg/ml，結(jié)果雖略微超過重癥感染時(shí)的萬古霉素血藥濃度范圍（15~20 μg/ml），但患者未見腎功能異常，繼續(xù)此常規(guī)治療方案，患者感染得到有效控制。

患者女，81歲，因急性消化道出血，十二指腸球部潰瘍穿孔并膿毒性休克入福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU，后腹水培養(yǎng)結(jié)果顯示革蘭陽性球菌生長，以萬古霉素0.5 g，q6 h靜脈滴注來抗感染治療，5 d后抽穩(wěn)態(tài)濃度血予以臨床藥學(xué)室進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果為22.14 μg/ml，結(jié)合患者檢測(cè)肌酐清除率較前有所升高，調(diào)整萬古霉素劑量為0.5 g，q12 h，并注意腎功能監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)劑量調(diào)整后患者肌酐清除率有所下降。

3 討論

采用直接沉淀法來處理血樣，與固相萃取法相比，此法操作簡單省時(shí)省力，更加適合于醫(yī)院用于檢測(cè)患者血藥濃度的模式。在蛋白沉淀劑的選擇中，就回收率方面來看，乙腈回收率幾乎為0，甲醇、高氯酸的回收率在60%左右，而硫酸鋅的回收率超過90%；而就沉淀效果來看，10%硫酸鋅的凈化效果明顯好于20%硫酸鋅及30%硫酸鋅，故選用直接沉淀法并以10%硫酸鋅做蛋白沉淀劑。在有機(jī)相的選擇中，選用乙腈時(shí)的色譜峰要明顯好于選用甲醇時(shí)，另外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用磷酸二氫鉀緩沖體系時(shí)，其緩沖鹽濃度過大會(huì)造成鹽析，導(dǎo)致柱壓升高，影響分離效果，并且，在pH值為3.2時(shí)，峰形較為對(duì)稱，且保留時(shí)間較合適，故選用乙腈-磷酸二氫鉀（pH=3.2）來作為流動(dòng)相。

自1958年開始，萬古霉素在臨床上被用于治療革蘭陽性菌引起的感染，其主要通過抑制細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞膜的通透性并影響RNA合成來起到抗菌作用。在應(yīng)對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物抵抗的感染時(shí)，萬古霉素能起到很好的效果，因而在臨床上是抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的一線用藥。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法來測(cè)定人血漿中萬古霉素濃度，并成功應(yīng)用于臨床。解決了由萬古霉素治療窗窄引發(fā)的一系列問題，實(shí)現(xiàn)了萬古霉素的個(gè)體化給藥。另外，基于準(zhǔn)確數(shù)據(jù)來進(jìn)行用藥指導(dǎo)也更能促進(jìn)臨床用藥的安全、經(jīng)濟(jì)、合理。當(dāng)然，本研究還存在著很多大的不足跟欠缺，如樣本量少，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行大量的臨床宣講提升樣本量，更重要的是今后的研究重點(diǎn)應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)原理制定劑量調(diào)整方案，更好地幫助臨床實(shí)施個(gè)體化給藥。