洞庭青鯽腸道細(xì)菌分離及分泌胞外酶的能力分析

李 娜，馬阿敏，王子悅，覃虹焱，姚 曲

（1.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；3.動物學(xué)湖南省高校重點實驗室，湖南 常德 415000）

洞庭青鯽（Dongtingking Crucian Carp），屬鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯽屬、鯽種，體高、背厚、個體大[1]，因背部顏色較深，故當(dāng)?shù)厮追Q黑殼子鯽魚。洞庭青鯽生長快速、富含營養(yǎng)，味道好，回捕率很高[2-3]。由于營養(yǎng)價值高，市場需求量大，因此養(yǎng)殖發(fā)展前景十分廣闊[4]。對于洞庭青鯽的研究主要集中在養(yǎng)殖、病害及遺傳分析等方面[5-9]，有關(guān)腸道微生物的研究尚未見報道。本文研究洞庭青鯽腸道細(xì)菌的分離及其分泌胞外酶的能力，對提高洞庭青鯽的健康養(yǎng)殖、增加餌料利用率、促進(jìn)生長均具有重要意義，也可為研究魚類益生菌提供理論依據(jù)。

1 洞庭青鯽養(yǎng)殖環(huán)境

目前人工養(yǎng)殖的洞庭青鯽原種引自湖南省澧縣北民湖，該湖是一個半封閉式的人造湖泊，調(diào)蓄容積15935萬m3，屬國家重點蓄洪垸區(qū)。該地年均氣溫16.5 ℃，平均日照時數(shù)1770.6 h，降水量1213 mm。洞庭青鯽親魚對培育池沒有嚴(yán)格要求，目前該魚已在數(shù)個省市推廣養(yǎng)殖，但伴隨著養(yǎng)殖密度及規(guī)模的擴(kuò)大，病害問題也日益增多，制約著洞庭青鯽的健康發(fā)展[10]。

2 試驗材料和方法

2.1 試驗材料

淡水魚類基礎(chǔ)培養(yǎng)基（F W A）：牛肉浸膏2.50 g、葡萄糖1.00 g、酵母浸膏2.50 g、蛋白胨5.00 g、NaCl 5.00 g、KH2PO40.20 g、MgSO40.05 g。

實驗魚：網(wǎng)捕并隨機(jī)采集的健康洞庭青鯽6尾，未分雌雄，2齡，健康活潑、掙扎有力、無病癥。

2.2 洞庭青鯽腸道菌分離純化

在實驗室無菌條件下，處理洞庭青鯽腸道。將洞庭青鯽樣本魚放置在無菌白瓷盤中，先用無菌水沖洗魚體表，再對洞庭青鯽樣本魚體表用75%酒精消毒。用無菌解剖剪刀小心解剖魚體腹腔。從肛門后剪開，掀起腹壁，漏出腸道。輕輕剝離出洞庭青鯽樣本魚體腸道，首先清除腸道外壁表面脂肪組織，然后在無菌條件下，用無菌解剖剪刀將腸道剪開一個小縱切口，暴露出腸道內(nèi)壁，用解剖剪刀背面輕輕刮去粘附于腸道內(nèi)的糞便及食物殘渣，最后用無菌水緩緩沖洗，除去殘留物。將用上述方法處理好的所有洞庭青鯽樣本魚腸的前段、中段和后段分別稱重，然后將6尾洞庭青鯽樣本的所有前段腸道混合，準(zhǔn)確稱取10 g前段腸道樣本備用。6尾洞庭青鯽樣本的所有中段腸道和后段腸道也采用此方法制備待用樣本。

2.3 菌株的簡單染色和革蘭氏染色

參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2.4 分泌胞外酶菌種篩選

參照文獻(xiàn)[12]配置好4種篩選培養(yǎng)基（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶），分別無菌澆注平板，待4種篩選平板凝固后，用接種針依次挑取菌株，點種在篩選板上，28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行觀察，測量并記錄其水解圈直徑和菌落直徑[13-16]。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種分離純化

通過稀釋平板法篩選出健康洞庭青鯽前段腸、中段腸和后段腸中的菌落，共24種，依次編號1—24。洞庭青鯽腸分離菌株菌落在固體平板培養(yǎng)基上的生長符合常規(guī)細(xì)菌的生長特征，分離株菌落顏色以淺黃色和乳白色居多。詳見表1—3。

3.2 簡單染色與革蘭氏染色結(jié)果

對從健康洞庭青鯽的前段腸、中段腸和后段腸篩選出的24株菌進(jìn)行簡單染色特性檢測，油鏡觀察可見，24株分離純化菌株中有5株為球狀菌，占比20.83%，其中前段腸1株、中段腸1株、后段腸3株，其余19株均為桿狀菌，占比79.17%，詳見表4—6。

表2 洞庭青鯽中段腸菌落特征

表3 洞庭青鯽后段腸菌落特征

對從健康洞庭青鯽的前段腸、中段腸和后段腸篩選出的24株菌進(jìn)行革蘭氏染色檢測，油鏡觀察可見，8株分離純化菌株為革蘭氏陽性菌（G+），占比33.33%，其余16株為革蘭氏陰性菌（G-），占比66.67%。G-菌株數(shù)量多于G+菌株，詳見表4—6。

3.3 分泌胞外酶菌株的篩選結(jié)果

本試驗從健康洞庭青鯽腸道篩選出24 株菌，分泌胞外蛋白酶菌株（22/24）占比91.67%；分泌胞外脂肪酶菌株（18/24）占比75.00%；分泌胞外淀粉酶菌株（10/24）占比41.67%；分泌胞外纖維素酶菌株（13/24）占比54.17%。

經(jīng)分泌胞外蛋白酶篩選培養(yǎng)基篩選出健康洞庭青鯽前段、中段、后段腸分別有6株、8株和8株細(xì)菌分泌蛋白酶；經(jīng)分泌胞外脂肪酶篩選培養(yǎng)基篩選出健康洞庭青鯽前段、中段、后段腸分別有5株、7株和6株細(xì)菌分泌脂肪酶；經(jīng)分泌胞外淀粉酶篩選培養(yǎng)基篩選出健康洞庭青鯽前段、中段、后段腸分別有1株、4株和5株細(xì)菌分泌淀粉酶；經(jīng)分泌胞外纖維素酶篩選培養(yǎng)基篩選出健康洞庭青鯽前段、中段、后段腸分別有4株、3株和6株細(xì)菌分泌纖維素酶。

在分泌胞外蛋白酶的22株菌中，有G+菌7株（球菌1株，桿菌6株）；G-菌15株（球菌4株，桿菌11株）；分泌胞外脂肪酶的18株菌中，有G+菌6株（球菌1株，桿菌5株）；G-菌12株（球菌4株，桿菌8株）；分泌胞外淀粉酶的10株菌中，有G+菌1株（桿菌）；G-菌9株（球菌2株，桿菌7株）；分泌胞外纖維素酶的13株菌中，有G+菌5株（球菌1株，桿菌4株）；G-菌8株（球菌2株，桿菌6株）。洞庭青鯽腸道優(yōu)勢菌群以G-菌為主，桿菌數(shù)量高于球菌數(shù)量，說明洞庭青鯽腸道中G-菌分泌胞外酶能力強(qiáng)于G+菌。

從健康洞庭青鯽腸道中分離出24株菌，有22 株分泌胞外酶，分泌蛋白質(zhì)酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等4種胞外酶的菌株為13、17、22和23號菌；分泌3種胞外酶的菌株共12株，依次為2、6、7、8、10、12、14、15、16、20、21和24號菌；分泌2種胞外酶的菌株為4、5、11、18和19號菌等；9號菌僅分泌1種胞外酶；1號和3號2株菌不分泌胞外酶。詳見表4—7。

表4 洞庭青鯽前段腸1～8號菌株分泌胞外酶活性

表5 洞庭青鯽中段腸9～16號菌株分泌胞外酶活性

表6 洞庭青鯽后段腸17～24號菌株分泌胞外酶活性

表7 洞庭青鯽各段腸分離菌分泌胞外酶能力統(tǒng)計

4 討論

從健康洞庭青鯽腸道中分離出24株細(xì)菌，分泌胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的菌株分別為22株、18株、10株和13株，在菌株總數(shù)中的占比依次為91.67%、75.00%、41.67%和54.17%。健康洞庭青鯽腸道24株分離菌中，有4株菌能分泌4種胞外酶，12株菌能分泌3種胞外酶，5株菌能分泌2種胞外酶，1株菌能分泌1種胞外酶，2株菌不分泌胞外酶。分泌胞外酶的菌株數(shù)量從高到低依次是分泌胞外蛋白酶菌株＞分泌胞外脂肪酶菌株＞分泌胞外纖維素酶菌株＞分泌胞外淀粉酶菌株，其中，分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的菌株數(shù)量多于分泌胞外淀粉酶和胞外纖維素酶菌株數(shù)量。魚類腸道的優(yōu)勢菌群一般為革蘭氏陰性菌，陽性菌比例雖較小但也是腸道菌群的組成部分[13-14]。試驗結(jié)果顯示，在24株分離菌中，有8株為G+菌，占比33.33%；有16株為G-菌，占比66.67%，G-菌株數(shù)量多于G+菌株。具有分泌胞外酶能力的細(xì)菌以G-菌為主，表明洞庭青鯽腸道菌群分泌胞外酶能力方面，G-菌更具優(yōu)勢。

動物自身分離出的菌株用于該種屬動物的微生態(tài)制劑更有助于菌株在宿主體內(nèi)定植[15]。微生態(tài)制劑的獨特功效越來越受到重視[16]，既能促進(jìn)水生生物生長與繁殖，又能優(yōu)化養(yǎng)殖水體環(huán)境。本試驗中分泌胞外酶能力強(qiáng)的菌株可進(jìn)一步研究其生長最適溫度、pH、鹽度、金屬離子等，以期為作為益生菌添加到洞庭青鯽配合飼料中的應(yīng)用提供參考。