HLA-DRB1/DQB1基因多態(tài)性與廣西壯族女性乳腺癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究▲

盧庭婷 梁惠萍 陳基強(qiáng) 譚麗麗

(廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧市 530021)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示全球范圍內(nèi)每年有接近40萬(wàn)人死于乳腺癌。近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)婦女的身體健康[1]。目前關(guān)于該病的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究顯示其發(fā)生發(fā)展與遺傳和環(huán)境等因素及基因多態(tài)性有關(guān)[2-3]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)基因位于第6號(hào)染色體短臂上，是人類(lèi)基因組中最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性基因體系，共包括Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)、Ⅲ類(lèi)三個(gè)基因區(qū)，其中HLA-Ⅱ類(lèi)基因包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP及一些與抗原處理和提呈相關(guān)的基因。本研究團(tuán)隊(duì)此前已發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1基因與肝癌、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4-5]。近期相關(guān)報(bào)道顯示，乳腺癌的發(fā)生可能與HLA-DR/DQ基因多態(tài)性相關(guān)，患者體內(nèi)存在易感基因或保護(hù)基因[6-7]。為此，本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法及基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HLA-DRB1/DQB1基因多態(tài)性，分析其與廣西壯族女性乳腺癌患者遺傳易感性的關(guān)系，以期為該地區(qū)乳腺癌的防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年11月至2021年9月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院收治的90例乳腺癌患者為乳腺癌組，另選取同時(shí)期同一地區(qū)的85例健康體檢者為健康體檢組，所有入選對(duì)象均為廣西壯族女性。乳腺癌組患者年齡38～64(42.58±12.09)歲，健康體檢組年齡35～68(44.29±11.82)歲。兩組研究對(duì)象的基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乳腺癌組患者為首次經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；(2)所有研究對(duì)象間無(wú)血緣關(guān)系；(3)精神狀態(tài)正常，能順利配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤病史；(2)健康體檢組體檢者既往有乳腺疾病史；(3)合并自身免疫和血液系統(tǒng)疾??；(4)有遺傳病家族史；(5)重要器官功能障礙。本研究經(jīng)我院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情且同意。

1.2 方法

1.2.1 白細(xì)胞DNA的提取與純度檢測(cè) 采集患者晨起空腹肘靜脈血2 mL置于抗凝管內(nèi)，加入2倍體積的細(xì)胞分離液，以1 500 r/min離心30 min，取上層白細(xì)胞并用磷酸緩沖鹽溶液清洗2遍，采用酚氯仿法提取細(xì)胞中的DNA。然后取少量DNA樣本，測(cè)定DNA在波長(zhǎng)為230 nm、260 nm、280 nm處的吸光度值(A)，如果A260/A280>1.7、A260/A230>2.0，則所取DNA標(biāo)本的純度合格，否則需再次采集標(biāo)本。

1.2.2 HLA-DRB1基因分型檢測(cè) 選擇天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的HLA-DR基因分型低分辨測(cè)定試劑盒進(jìn)行基因分型檢測(cè)，使用德國(guó)耶拿公司的高速PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。再通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)對(duì)有意義的等位基因進(jìn)行亞型分型。

1.2.3 HLA-DQB1基因分型檢測(cè) 選用天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的HLA-DQ基因分型高分辨測(cè)定試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%(含核酸染色劑Gold View 0.1 μg/mL)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為25 min，然后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下成像，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的結(jié)果分型表來(lái)判讀基因分型情況。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)并計(jì)算兩組等位基因頻率(allele frequency，AF)。AF代表某個(gè)基因位點(diǎn)上某種特定等位基因與該位點(diǎn)上所有基因總數(shù)之間的比率，AF=X/2n(X代表某種等位基因在這一群體中的數(shù)目，n代表為這一群體的總例數(shù))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間AF的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用95%置信區(qū)間(95%CI)和比值比(OR)分析HLA-DRB1和HLA-DQB1與乳腺癌發(fā)病危險(xiǎn)度間的關(guān)系，得到的P值采用Bonferroni法校正，記為Pc。以Pc<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HLA-DRB1等位基因多態(tài)性頻率比較 乳腺癌組和健康體檢組均檢出13種HLA-DRB1等位基因，其中乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF為6.1%(11/180)，健康體檢組HLA-DRB1*01 的AF為1.8%(3/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF高于健康體檢組(Pc=0.014，OR=3.345)。乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF為3.9%(7/180)，健康體檢組HLA-DRB1*16的AF為9.4%(16/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF低于健康體檢組(Pc=0.004，OR=0.418)。兩組間其他類(lèi)型HLA-DRB1的AF比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均Pc>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組受檢者HLA-DRB1等位基因多態(tài)性頻率比較

2.2 HLA-DRB1相關(guān)等位基因亞型頻率比較 通過(guò)基因測(cè)序?qū)LA-DRB1*01、HLA-DRB1*16進(jìn)行等位基因亞型分型并進(jìn)行頻率比較，兩組HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*16均檢出兩種等位基因亞型。其中，乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF為4.4%(8/180)，健康體檢組HLA-DRB1*0102的AF為0.6%(1/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF高于健康體檢組(Pc=0.026，OR=8.519)；乳腺癌組HLA-DRB1*1602的AF為2.2%(4/180)，健康體檢組HLA-DRB1*1602的AF為7.1%(12/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*1602的AF低于健康體檢組(Pc=0.013，OR=0.144)。見(jiàn)表2。

表2 兩組受檢者HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*16等位基因亞型頻率比較

2.3 HLA-DQB1等位基因多態(tài)性頻率比較 乳腺癌組和健康體檢組均檢出14種HLA-DQB1等位基因，其中乳腺癌組HLA-DQB1*0201 的AF為38.9%(70/180)，健康體檢組HLA-DQB1*0201的AF為14.1%(24/170)，乳腺癌組HLA-DQB1*0201的AF明顯高于健康體檢組(Pc=0.016，OR=3.381)。兩組其他類(lèi)型HLA-DQB1的AF比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均Pc>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組受檢者HLA-DQB1等位基因多態(tài)性頻率比較

3 討 論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響女性患者的身心健康。國(guó)際癌癥中心預(yù)測(cè)，到2040年全球約有300萬(wàn)乳腺癌患者[8]。目前關(guān)于乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但隨著對(duì)腫瘤分子基因研究的不斷深入，遺傳因素已被確定與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，尋找與乳腺癌遺傳易感性有關(guān)的基因，對(duì)從基因水平上認(rèn)識(shí)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及制訂有效的乳腺癌防治策略具有重要的臨床意義。HLA是反映機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)，其能夠介導(dǎo)抗原呈遞至細(xì)胞表面，使機(jī)體T淋巴細(xì)胞識(shí)別內(nèi)源性抗原肽，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。HLA-Ⅱ類(lèi)區(qū)域中幾乎所有的基因均代表免疫相關(guān)功能，承擔(dān)著免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，HLA-Ⅱ類(lèi)分子在抗原識(shí)別、免疫應(yīng)答及病毒清除這一系列過(guò)程中具有重要作用，與許多感染性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。HLA等位基因存在多態(tài)性，HLA-DR/DQ基因的多態(tài)性是免疫抗原多態(tài)性的決定性因素，可影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)HLA等位基因的多態(tài)性與乳腺癌的易感性相關(guān)，但由于HLA在不同種族、不同地域人群中的分布各不相同，因此不同地區(qū)學(xué)者得出的研究結(jié)論也不盡相同[6-7,12]。研究顯示，在意大利中部人群中乳腺癌與HLA-DRB1*11:01和HLA-DRB1*10:01 AF增加有關(guān)[6]。而非洲布基納法索的學(xué)者則未發(fā)現(xiàn)攜帶HLA-DRB1*11和HLA-DRB1*12等位基因與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在直接關(guān)聯(lián)[13]。廣西是一個(gè)多民族聚居的地區(qū)，其中壯族人口約占全區(qū)戶(hù)籍總?cè)丝诘?1.36%，廣西壯族人群的遺傳背景與我國(guó)其他民族和地區(qū)有顯著的差別。因此，其他種族和地區(qū)的研究可能并不適用于廣西婦女。

本研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物技術(shù)擴(kuò)增乳腺癌患者和健康體檢者的HLA-DRB1、HLA-DQB1基因，并測(cè)定其核酸序列，比較兩組受檢者不同等位基因的基因頻率。結(jié)果顯示兩組受檢者均檢出13種HLA-DRB1等位基因、14種HLA-DQB1等位基因。乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF為6.1%(11/180)，高于健康體檢組的1.8%(3/170)(Pc=0.014，OR=3.345)；乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF為3.9%(7/180)，低于健康體檢組的9.4%(16/170)(Pc=0.004，OR=0.418)；乳腺癌組HLA-DQB1*0201的AF為38.9%(70/180)，高于健康體檢組的14.1%(24/170)(Pc=0.016，OR=3.381)。進(jìn)一步分析HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*16兩種等位基因亞型，結(jié)果顯示乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF高于健康體檢組(Pc=0.026，OR=8.519)，HLA-DRB1*1602的AF低于健康體檢組(Pc=0.013，OR=0.144)。這表明，對(duì)于廣西地區(qū)壯族女性，HLA-DRB1*0102、HLA-DQB1*0201基因是乳腺癌的易感基因，而HLA-DRB1*1602基因是其保護(hù)基因。

綜上所述，HLA-DRB1*0102、HLA-DQB1*0201可能是廣西壯族女性乳腺癌的易感基因，攜帶上述基因的廣西壯族女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，而HLA-DRB1*1602可能是廣西壯族女性乳腺癌的保護(hù)基因。但由于乳腺癌的發(fā)生與不同族群的遺傳背景關(guān)系密切，其他地區(qū)和種族的乳腺癌的易感基因型和保護(hù)基因型仍待進(jìn)一步研究。