CT引導(dǎo)下經(jīng)皮活檢聯(lián)合宏基因二代測序技術(shù)在脊柱感染診治中的應(yīng)用

胡津銓，王 晨，顧一飛，陳華江，王新偉，陳 宇，袁 文

海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院骨科，上海 200003

脊柱感染在我國并不少見，因其臨床癥狀大多不典型，影像學(xué)表現(xiàn)不具特異性，診斷較為困難。絕大多數(shù)脊柱感染患者需要進(jìn)行藥物治療，而藥物治療的基礎(chǔ)是獲得明確的病原學(xué)依據(jù)。脊柱感染病灶常位于椎前，位置結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，又常鄰近重要血管和臟器，病灶組織標(biāo)本難以獲得［1-2］。且傳統(tǒng)實驗室檢驗手段較為單一、敏感程度不高，獲得病原學(xué)診斷仍然存在困難［3-4］。

宏基因組二代測序（mNGS）技術(shù)是一種具有巨大應(yīng)用前景的微生物診斷工具，其擁有龐大的數(shù)據(jù)庫，可以根據(jù)測序的結(jié)果作出診斷提示，在細(xì)菌及真菌感染性疾病的診斷中具有較大優(yōu)勢［5］。本課題組通過CT引導(dǎo)下經(jīng)皮活檢獲得脊柱感染患者病原學(xué)組織后，采用mNGS技術(shù)獲得的病原學(xué)結(jié)果選擇藥物進(jìn)行個體化治療，取得較好效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2019年2月—2021年2月收治脊柱感染患者32例，其中男17例、女15例，年齡為17 ～ 71（42.0±15.5）歲，病程為2 ～ 14（7.0±3.3）個月 ；病灶位于胸椎9例，胸腰椎9例，腰椎及骶椎14例。臨床體征以軸性疼痛為主，其中15例因脊柱局部不穩(wěn)、后凸畸形或脊髓、神經(jīng)受壓而產(chǎn)生神經(jīng)癥狀。

1.2 穿刺方法

穿刺前詳細(xì)了解患者病史，排除手術(shù)禁忌證，包括出血性疾病史或凝血功能不全、體質(zhì)衰弱難以平臥至穿刺結(jié)束者。術(shù)前與患者及其家屬談話并告知風(fēng)險，使其了解手術(shù)操作的意義，減少術(shù)前緊張心理。同時與影像介入科醫(yī)師一起詳細(xì)評估患者病變位置，毗鄰的臟器、血管及神經(jīng)，設(shè)計穿刺路徑?；颊咄ǔＨ「┡P位，先通過CT定位設(shè)計最佳的穿刺點、進(jìn)針路徑、角度及深度；對患者進(jìn)行皮膚消毒及局部麻醉后，在CT定位下進(jìn)行經(jīng)皮穿刺，確認(rèn)針尖進(jìn)入病灶后，抽出膿性液體送檢。如膿腫較大則選擇在膿腫低位穿刺，放置引流管進(jìn)行持續(xù)引流，同時方便行病灶局部藥物化療。

1.3 病原學(xué)診斷

實驗室檢查：將穿刺獲得的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及涂片、真菌培養(yǎng)及涂片、結(jié)核培養(yǎng)及涂片，并進(jìn)行藥物敏感性試驗。

mNGS技術(shù)：將穿刺獲得的標(biāo)本放入無菌試劑管中，保存于4℃冰箱內(nèi)，次日進(jìn)行樣本處理和DNA提取。按照流程用溶壁酶進(jìn)行酶破壁反應(yīng)，再使用DNA提取試劑盒提取DNA。對所提取的DNA進(jìn)行酶切片段化、末端修復(fù)、接頭連接及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），構(gòu)建文庫并進(jìn)行測序。將測序數(shù)據(jù)（reads）去除低質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。將高質(zhì)量數(shù)據(jù)與人參考基因組序列進(jìn)行比對，并將比對上的數(shù)據(jù)去除。剩余數(shù)據(jù)去除低復(fù)雜度數(shù)據(jù)后，與華大基因PMDB病原數(shù)據(jù)庫（包括6 350種細(xì)菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲的基因組序列）進(jìn)行比對。選擇對比細(xì)菌與真菌2個項目，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低及其他檢測結(jié)果來判斷可能的病原體。

1.4 治療

所有患者根據(jù)病原學(xué)診斷進(jìn)行規(guī)范藥物治療，15例脊柱局部不穩(wěn)，后凸畸形，脊髓、神經(jīng)受壓的患者穿刺術(shù)后盡快擇期進(jìn)行病灶清除植骨融合內(nèi)固定術(shù)，術(shù)后繼續(xù)藥物治療。所有患者在治療6個月后復(fù)查三維CT重建及實驗室檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用配對設(shè)計χ2檢驗 ；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

32例患者中29例經(jīng)CT引導(dǎo)下穿刺，成功獲得標(biāo)本，CT穿刺取樣成功率為90.6%。29例患者的一般資料、病原學(xué)檢測結(jié)果和診斷結(jié)果見表1。在獲得的29例標(biāo)本中，mNGS技術(shù)獲得明確病原學(xué)依據(jù)27例，總體檢測陽性率為93.1%（27/29），常規(guī)實驗室培養(yǎng)獲得病原學(xué)依據(jù)22例，陽性率為75.9%（22/29），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。mNGS檢測時間為（1.59±0.28）d，常規(guī)實驗室培養(yǎng)檢測時間為（12.8±3.25）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表1 患者一般資料

本組檢出的主要病原體為結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、曲霉菌、隱球菌、布魯桿菌，只有1例沒有通過mNGS技術(shù)及實驗室檢查獲得病原學(xué)結(jié)果，采用經(jīng)驗用藥方案治療。脊柱結(jié)核的藥物治療：新發(fā)肺結(jié)核或肺外結(jié)核患者的治療方案為強(qiáng)化期2個月異煙肼（H）、利福平（R）、吡嗪酰胺（E）、乙胺丁醇（Z）4聯(lián)用藥+鞏固期4個月異煙肼（H）和利福平（R）聯(lián)合用藥（2HRZE/4HR方案）。布魯桿菌感染的藥物治療：多西環(huán)素+利福平+第三代頭孢菌素類藥物，療程3個月?；撔约怪赘鶕?jù)藥敏結(jié)果，選擇敏感的抗生素靜脈給藥治療2個月。真菌性脊柱炎根據(jù)藥敏結(jié)果選用敏感抗生素（伏立康唑等），治療6個月［6-8］。所有患者藥物治療2周后C反應(yīng)蛋白（CRP）水平和紅細(xì)胞沉降率（ESR）均較治療前下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）；治療后6個月疼痛視覺模擬量表（VAS）評分［9］和Oswestry功能障礙指數(shù)（ODI）［10］均較治療前改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表2）。

表2 治療前后指標(biāo)N=29，±s

表2 治療前后指標(biāo)N=29，±s

注 ：*與治療前比較，P ＜ 0.05。

時間CRP/（mg·L-1）ESR/（mm·h-1）VAS評分ODI（%）治療前 28.1±15.9 54.7±17.0 5.3±1.7 43.3±8.4治療后 8.9±6.5* 15.2±9.7* 3.9±1.6* 19.1±5.8*

3 討 論

在大多數(shù)情況下，脊柱感染的診斷和治療需要脊柱外科、放射科和感染科醫(yī)師進(jìn)行多學(xué)科會診，其多為細(xì)菌引起，真菌感染也可能發(fā)生［3，7］。根據(jù)病原體的不同，脊柱感染可分為化膿性（細(xì)菌引起）或肉芽腫性（結(jié)核分枝桿菌和真菌引起）。影像學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)脊柱感染通常累及椎間盤，形成椎間盤炎，同時病灶也可向椎管內(nèi)擴(kuò)散，累及硬膜外腔及椎旁軟組織。大多數(shù)情況下，感染并不局限于一個解剖腔室，通常會擴(kuò)散并涉及脊柱不同部位，并且根據(jù)病原菌不同各有特點，如脊柱結(jié)核常累及多個椎體，化膿性脊柱炎則很少累及超過2個椎體［11］；同時，脊柱結(jié)核對椎間盤破壞較輕、對椎體骨破壞較重，而化膿性脊柱炎對椎間盤破壞較重、對椎體骨破壞較輕。脊柱結(jié)核骨破壞較重，椎體內(nèi)膿腫常見，更易形成椎體塌陷、破壞、死骨或鈣化，發(fā)生局部后凸畸形繼而產(chǎn)生神經(jīng)癥狀，所以除了藥物治療外還需外科手術(shù)干預(yù)［12-13］。

除了上述影像學(xué)的特征性表現(xiàn)外，脊柱感染的診斷還需要結(jié)合完整的病史和實驗室檢查結(jié)果，在此過程中必須調(diào)查及確定可能的感染風(fēng)險因素。初始血液檢查應(yīng)包括白細(xì)胞計數(shù)和炎性標(biāo)志物，如ESR和CRP。CRP是靈敏度較高的感染指標(biāo)，且在75%的感染病例中可觀察到ESR升高，CRP和ESR/白細(xì)胞計數(shù)升高以及與脊柱感染（如背痛和發(fā)燒）一致的臨床癥狀提示脊柱感染可能［14］。同時，CRP也是抗生素治療效果的一個重要標(biāo)志，治療成功后CRP能迅速恢復(fù)到正常水平；而 ESR在臨床癥狀改善后依然保持長時間的升高［15］。與CRP和ESR相比，白細(xì)胞計數(shù)對于脊柱感染的診斷價值較小，55%的脊柱感染患者白細(xì)胞計數(shù)正常［3，16］。因此，本研究隨訪中采用CRP和ESR來反映炎癥變化情況。在診斷的過程中，病史也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，如布魯桿菌脊柱炎患者通常與牧區(qū)生活史、接觸過牛羊家畜有關(guān)，真菌性脊柱炎患者則具有眾多風(fēng)險因素，可能有繼發(fā)性免疫缺陷（由人類免疫缺陷病毒引起的感染）及廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制等藥物濫用史［7，17］。

相比初始的血液及影像學(xué)檢查，病灶組織活檢的病原學(xué)依據(jù)是診斷脊柱感染的金標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合三維CT重建圖像的CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢是獲取病灶組織的重要途徑，有文獻(xiàn)［18］報道，CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢診斷脊柱感染的靈敏度高于90%。在穿刺過程中，能夠通過CT增強(qiáng)掃描明確前方血管及側(cè)方臟器的位置，做到精準(zhǔn)定位，清晰顯示穿刺路徑［19］。對于骶骨前方的膿腫，可行CT引導(dǎo)的破骨穿刺；對于較大膿腫，可在穿刺后放置固定引流管持續(xù)引流，并可通過引流管持續(xù)給藥進(jìn)行局部化療；此外，在行病灶清除減壓植骨融合術(shù)后，也可根據(jù)引流情況判斷是否清創(chuàng)徹底［20］。

近年來，mNGS技術(shù)不斷改進(jìn)并進(jìn)入臨床實踐，為復(fù)雜感染的病原學(xué)診斷提供了一種有力工具。相比于傳統(tǒng)實驗室檢查，mNGS技術(shù)的優(yōu)勢包括較短的檢測時間和基于大數(shù)據(jù)庫的無偏差的定量或半定量分析［21］。目前已有文獻(xiàn)報道了mNGS技術(shù)在病原體診斷中的應(yīng)用，包括呼吸系統(tǒng)感染［17］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染［22］、血液感染和關(guān)節(jié)感染等［23-24］以及脊柱感染［25-26］。本研究結(jié)果顯示，mNGS技術(shù)對病原體的檢測陽性率高于實驗室檢查，同時獲得結(jié)果的時間較短，大大提升了檢測效率，方便早期制訂治療方案。對于mNGS技術(shù)檢測結(jié)果的解讀要結(jié)合病史資料，雖然微生物的檢出序列數(shù)越高，致病可能性就越大，但某些胞內(nèi)菌（如結(jié)核分枝桿菌、傷寒桿菌、布魯桿菌）和厚壁菌（如真菌）即使檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能［27］，例如本組中的隱球菌、布魯桿菌和曲霉菌感染病例。

值得注意的是，本組中有1例患者mNGS技術(shù)和實驗室檢查結(jié)果都為陰性，給予抗結(jié)核藥物治療后炎性指標(biāo)無明顯下降，根據(jù)影像學(xué)及病史診斷為化膿性脊柱炎，采用經(jīng)驗性抗炎藥物治療后療效良好。本研究樣本量較小，所得結(jié)果可能存在偏倚，未來還需要開展多中心、大樣本的研究進(jìn)行驗證。

綜合來看，mNGS技術(shù)尚有一些缺點，比如其對于細(xì)菌感染（結(jié)核分枝桿菌除外）還難以提供詳細(xì)的藥物敏感性結(jié)果，同時其價格也較為昂貴，一定程度上增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。相信隨著mNGS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其診斷價值會不斷提升，成本及價格會逐漸降低，更好地用于臨床診療。