EBPR 工藝污泥中聚磷菌多樣性與除磷潛力評(píng)價(jià)方法

鄭少奎，羅焇湝

北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，水沙科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水環(huán)境模擬國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875

地表水體富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)造成藻華現(xiàn)象、打破水環(huán)境生態(tài)平衡，氮和磷濃度過(guò)高是藻華現(xiàn)象的誘因，其中磷是主要限制因子[1-2].污水處理廠是地表水體磷污染控制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在不同除磷技術(shù)中，強(qiáng)化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal,EBPR)工藝因?yàn)榻?jīng)濟(jì)性、可持續(xù)性等優(yōu)點(diǎn)在全世界污水處理廠得到了廣泛應(yīng)用[3-5].EBPR 工藝特指在厭氧-好氧交替運(yùn)行條件下活性污泥中某些能夠“超量吸磷”的微生物將水相中PO43—吸收并以胞內(nèi)多聚磷酸鹽顆粒(polyphosphate,Poly-P)形式轉(zhuǎn)移到污泥相中，最終通過(guò)排泥實(shí)現(xiàn)污水除磷的工藝目標(biāo)[1].早在1975 年，F(xiàn)uhs 等[6]注意到不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)的生活污水處理工藝存在超量吸磷現(xiàn)象，該“超量吸磷”微生物被命名為聚磷菌(polyphosphate accumulating organism,PAO)，在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)Acinetobacter屬被認(rèn)為是EBPR 工藝優(yōu)化研究的目標(biāo)PAO[7].1976 年Barnard 等首次提出了經(jīng)典的PAO“厭氧釋磷-好氧攝磷”機(jī)理[8]，并獲得了廣泛認(rèn)同.1999 年Hesselmann等將一株原Rhodocyclus屬PAO重新命名為“Candidatus accumulibacterphosphatis”[9]，后續(xù)調(diào)查表明實(shí)驗(yàn)室EBPR 工藝中Accumulibacter屬普遍存在超量吸磷現(xiàn)象[10]，世界上許多國(guó)家不同工藝污水處理廠該屬均具有較高的豐度(占細(xì)菌總數(shù)的4%～22%)[11-12]，至此Accumulibacter屬取代Acinetobacter屬成為近20 年來(lái)EBPR 工藝優(yōu)化研究的目標(biāo)PAO.

隨著越來(lái)越多PAO 新菌株被分離出來(lái)和PAO生理生化研究的不斷深入，尤其是反硝化聚磷現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為充實(shí)、完善EBPR 機(jī)理提供了豐富的理論基礎(chǔ).在非PAO 菌占優(yōu)勢(shì)、非PAO 菌具有初步除磷能力的活性污泥中，準(zhǔn)確識(shí)別、評(píng)價(jià)所有PAO(而不僅僅是此前研究聚焦的Accumulibacter屬和Acinetobacter屬PAO)的除磷潛力是闡明EBPR 工藝運(yùn)行機(jī)理、針對(duì)性地開展EBPR 工藝參數(shù)優(yōu)化升級(jí)研究的關(guān)鍵，而準(zhǔn)確評(píng)價(jià)所有PAO 除磷潛力的前提是必須闡明活性污泥中PAO 多樣性特征(當(dāng)前研究主要以分子生態(tài)學(xué)手段開展除磷潛力評(píng)價(jià)).該文選擇“phosphorus removal”“polyphosphate-accumulating organisms”和“phosphate-accumulating organisms”作為關(guān)鍵詞，在Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索了1980—2021 年在國(guó)際期刊上發(fā)表的生物除磷相關(guān)文獻(xiàn)(＞1 000 篇)，據(jù)此綜述了近40 年來(lái)EBPR 機(jī)理變遷，基于EBPR 工藝中分離得到的全部PAO 菌株信息歸納總結(jié)了PAO 多樣性特征(相關(guān)中文論文數(shù)量較少，未作為主要數(shù)據(jù)來(lái)源)，以此為依據(jù)客觀評(píng)價(jià)了當(dāng)前活性污泥PAO 除磷潛力評(píng)價(jià)方法的不足，并展望了未來(lái)重點(diǎn)研究方向，這些研究成果對(duì)于推動(dòng)EBPR 工藝優(yōu)化升級(jí)具有非常重要的理論與實(shí)際意義.

1 EBPR 機(jī)理變遷

在傳統(tǒng)EBPR 機(jī)理中，PAO 在厭氧條件下將胞內(nèi)多聚磷酸鹽顆粒(polyphosphate,Poly-P)分解為PO43—后釋放到水中，利用糖原以及Poly-P 分解產(chǎn)生的能量，吸收揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)(以乙酸為代表)，并以聚-β-羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)這種內(nèi)碳源物質(zhì)形式儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)；在好氧條件下，PAO 以分子氧(O2)作為電子受體氧化儲(chǔ)存的PHA 獲得能量，用來(lái)吸收水中PO43—并將其轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)Poly-P，同時(shí)完成生物質(zhì)生長(zhǎng)和糖原合成[13]，具體生化途徑如圖1 所示.

隨著PAO 生理生化研究的不斷深入，傳統(tǒng)EBPR機(jī)理近年來(lái)受到了較多質(zhì)疑.例如，作為EBPR 工藝優(yōu)化研究的目標(biāo)PAO 屬，多個(gè)Acinetobacter屬菌株生理生化特征的研究表明，其在厭氧條件下并沒(méi)有吸收乙酸合成PHA，不符合傳統(tǒng)EBPR 代謝模型[15]；1985 年Ohtake 等[16]在好氧-厭氧-好氧交替培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Acinetobacter calcoaceticusStrain IAM 12087T在厭氧環(huán)境下并沒(méi)有顯著吸收乙酸，同時(shí)厭氧環(huán)境并不能激發(fā)這種PAO 在好氧環(huán)境下的聚磷能力；Daly等[17]發(fā)現(xiàn)，無(wú)厭氧預(yù)培養(yǎng)時(shí)，Pseudomonassp.PHR6在好氧下培養(yǎng)48 h 后即出現(xiàn)顯著的生物聚磷現(xiàn)象；Yadav 等[18]將12 種PAO 直接投加到好氧連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器后觀察到了顯著的生物聚磷現(xiàn)象.

反硝化聚磷現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)豐富了EBRP 機(jī)理的內(nèi)涵.1988 年，Vlekke 等[19]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用NO3—作為唯一電子受體同樣可以誘導(dǎo)生物聚磷現(xiàn)象的發(fā)生(即某些反硝化細(xì)菌具備生物聚磷能力).隨后很多研究均證實(shí)了該現(xiàn)象的普遍存在：一些PAO 除了可以在好氧條件下過(guò)量攝磷以外，還可以在缺氧(DO 濃度小于0.5 mg/L)狀態(tài)下利用NO3—或NO2—作為電子受體氧化細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的PHA，同時(shí)完成過(guò)量攝磷，該過(guò)程被稱為反硝化聚磷，相關(guān)微生物被稱為反硝化聚磷菌(denitrifying phosphate accumulating organism,DPAO)[20].研究者提出的厭氧-缺氧除磷的具體生化途徑如圖2 所示，厭氧段DPAO 的生化代謝途徑與PAO 相同；在缺氧段，DPAO 利用NO3—/NO2—代替O2作為電子受體氧化PHA 獲得能量，完成PO43—吸收和Poly-P 合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、合成糖原等反應(yīng)，也就是在缺氧段同時(shí)實(shí)現(xiàn)了反硝化脫氮和聚磷[21].在這個(gè)過(guò)程中，PHA 不僅為PO43—吸收和Poly-P 合成提供能量，同時(shí)還為反硝化反應(yīng)提供碳源[22]，實(shí)現(xiàn)了一碳兩用[23]，與傳統(tǒng)生物脫氮除磷工藝(如A2O 工藝)相比，可節(jié)省50%左右的碳源、30%的供氧量，同時(shí)減少50%的污泥產(chǎn)量[24].

2 基于PAO 分離菌株信息的EBPR 工藝活性污泥PAO 多樣性特征

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前從不同污水EBPR 工藝活性污泥中共分離出142 株P(guān)AO 菌株(包括70 株DPAO)，其信息整理后如圖3 所示.由圖3 可見(jiàn)，活性污泥中PAO廣泛分布于變形菌門、放線菌門、厚壁菌門以及芽單胞菌門，并以變形菌門為主(82%)，系統(tǒng)發(fā)育差異極大，具有異常豐富的多樣性.這些PAO 共分屬于42個(gè)菌屬，其中Acinetobacter屬PAO 占比最高(29%)(也是最早發(fā)現(xiàn)的PAO 屬)，其次為Pseudomonas(15%)、Tetrasphaera(4%)、Alcaligenes(4%)屬.盡管近20 年來(lái)EBPR 工藝優(yōu)化研究聚焦于Accumulibacter屬，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果中Accumulibacter屬PAO 較少，這可能與該屬PAO 難以分離培養(yǎng)[26]有關(guān).在上述PAO 屬中，Acinetobacter屬中還包含了最多(27%)的DPAO，全部PAO 菌株中共有83 株已定種.

2.1 變形菌門(Proteobacteria)

目前從EBPR 工藝活性污泥中分離得到的變形菌門PAO分屬于α變形菌綱(10%)、β變形菌綱(23%)和γ變形菌綱(67%)等3個(gè)菌綱.其中，α 變形菌綱PAO 分屬于2 個(gè)菌目5 個(gè)菌科Agrobacterium、Paracoccus、Rhodobacter等6 個(gè)菌屬，其中Paracoccus屬PAO 占比最高，達(dá)到33%；β 變形菌綱PAO 分屬于3 個(gè)菌目8 個(gè)菌科Alcaligenes、Dechloromonas、Delftia等13 個(gè)菌屬，其中Alcaligenes屬和Brachymonas屬PAO 的占比(19%)最多；γ變形菌綱PAO分屬于5個(gè)菌目7個(gè)菌科Acinetobacter、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas等10 個(gè)菌屬，其中Acinetobacter屬PAO 占比(54%)最多.α 變形菌綱已定種的PAO共5 種(該研究中亞種或變種歸入同一種，下同)，包括(受論文篇幅所限未提供相關(guān)引文，根據(jù)菌名可檢索到相關(guān)文獻(xiàn)，下同)Agrobacteriumradiobacter、Agrobacterium tumefaciens*、Ochrobactrum anthropi*、Paracoccus denitrificans*和Rhodobacter sphaeroides(*指該株P(guān)AO 同時(shí)也是DPAO，下同).β 變形菌綱已定種PAO 共8 種，包 括Alcaligenes denitrificans、Aquaspirillum dispar*、Burkholderia cepacia*、Casimicrobium huifangae、Dechloromonas aromatica、Delftia acidovorans*、Delftia lacustris*和Delftia tsuruhatensis*.γ 變形菌綱已定種PAO 共25 種，包括Acinetobacter bouvetii*、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii*、Acinetobacterlwoffi、Acinetobacteroryzae*、Acinetobacter tandoii*、Aeromonas hydrophila*、Aeromonas media*、Aeromonas salmonicida*、Citrobacter portucalensis*、Enterobacter cloacae*、Moraxella lacunata、Klebsiella oxytoca*、Pseudomonas aeruginosa*、Pseudomonas fluorescens*、Pseudomonas mendocina、Pseudomonaspseudoalcaligenes*、Pseudomonas putida*、Pseudomonas putrefaciens、Pseudomonas simiae*、Pseudomonas stutzeri*、Pseudoxanthomonas mexicana*、Serratia marcescens和Shewanella putrefaciens*.

2.2 放線菌門(Actinobacteria)

目前從EBPR 工藝活性污泥中分離得到的放線菌門PAO 分屬于3 個(gè)菌目7 個(gè)菌科Tetrasphaera、Microlunatus、Aureobacterium等9個(gè)菌屬，其中Tetrasphaera屬PAO 占比最多(29%).已定種PAO共6 種，即Aureobacterium saperdae、Corynebacterium variabile、Microlunatus phosphovorus、Tetrasphaera australiensis、Tetrasphaera elongata和Tetrasphaera japonica.

2.3 厚壁菌門(Firmicutes)

目前從EBPR 工藝活性污泥中分離得到的厚壁菌門PAO 分屬于1 個(gè)菌綱2 個(gè)菌目3 個(gè)菌科Bacillus、Staphylococcus和Streptococcus等3 個(gè)菌屬，其中Bacillus屬PAO 占比最多(50%).已定種PAO有4 種，即Bacillus cereus*、Bacillus subtilis*、Staphylococcus aureus和Staphylococcus auricularis.

2.4 芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)

目前從EBPR 工藝活性污泥中分離得到的芽單胞菌門PAO 僅有1 株，即Gemmatimonadetes 綱Gemmatimonadales 目 Gemmatimonadaceae 科Gemmatimonas屬Gemmatimonas aurantiaca.對(duì)比生物脫氮系統(tǒng)異養(yǎng)硝化菌株信息[27]，發(fā)現(xiàn)許多上述PAO 菌種被報(bào)道同時(shí)具備反硝化能力，也就是異養(yǎng)硝化聚磷菌，包括Acinetobacter junii、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas fluorescens、Alcaligenes denitrificans、Klebsiella oxytoca、Paracoccus denitrificans、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Aeromonas salmonicida和Enterobacter cloacae.

3 EBPR 工藝活性污泥PAO 除磷潛力的評(píng)價(jià)方法

EBPR 工藝中活性污泥除磷能力主要通過(guò)PAO超量吸磷作用實(shí)現(xiàn)，而非PAO 菌因巨大的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)其生長(zhǎng)過(guò)程也能夠提供一定的除磷能力，在這種情況下準(zhǔn)確地識(shí)別、評(píng)價(jià)活性污泥PAO 除磷潛力將是推動(dòng)EBPR 工藝優(yōu)化升級(jí)的關(guān)鍵.調(diào)研結(jié)果表明，目前絕大多數(shù)研究分別根據(jù)活性污泥中PAO 豐度、胞內(nèi)Poly-P 含量、PAO 代謝活性的差異來(lái)評(píng)價(jià)活性污泥PAO 除磷潛力，這3 種方式占目前相關(guān)研究的比例分別為76%、13%和11%.其中，PAO 豐度、胞內(nèi)Poly-P 含量是活性污泥PAO 生物聚磷作用的直接體現(xiàn)，PAO 豐度或胞內(nèi)Poly-P 含量越高，活性污泥PAO 除磷潛力就越大，PAO 對(duì)EBPR 工藝除磷效果的貢獻(xiàn)就越大.相比之下，活性污泥PAO 代謝活性(如好氧吸磷速率、厭氧釋磷速率[28-29]、碳源吸收速率、PHA 利用速率[30]、ATP 或NADPH 產(chǎn)生量[8]等)則是活性污泥PAO 除磷潛力的間接反映.此外，筆者以“metagenome、polyphosphate”與“metabonomics、polyphosphate”作為摘要及關(guān)鍵詞在Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)合并檢索，共得到11 篇不同領(lǐng)域文獻(xiàn)，表明宏基因組學(xué)與代謝組學(xué)在PAO 功能與性能分析中雖有所應(yīng)用，但研究較少.因此，本文重點(diǎn)綜述EBPR 工藝活性污泥PAO 豐度、胞內(nèi)Poly-P 含量檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀.

3.1 PAO 豐度檢測(cè)方法

調(diào)研表明，活性污泥PAO 豐度檢測(cè)主要依托熒光原位雜交(fluorescencein situhybridization,FISH)、高通量測(cè)序或變性梯度凝膠電泳、定量PCR 等分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段，相關(guān)研究分別占文獻(xiàn)總數(shù)的67%、20%和13%.

準(zhǔn)確的FISH 檢測(cè)結(jié)果取決于特異性探針的全面性和特異性.2000年Crocetti等設(shè)計(jì)了針對(duì)Accumulibacter16SrRNA不同靶向序列位點(diǎn)的PAO462探針、PAO651 探針和PAO846 探針[10]，是采用FISH 法檢測(cè)污泥PAO 豐度時(shí)應(yīng)用最廣泛的3 種特異性探針，更常見(jiàn)的做法是將上述3 種探針等量混合制成PAOMIX探針以提高Accumulibacter豐度檢測(cè)的準(zhǔn)確性[31-34]，而其他PAO 探針的研究與使用則較為少見(jiàn)(見(jiàn)表1).例如，Li 等[31]采用PAOMIX探針檢測(cè)了缺氧-好氧SBR 反應(yīng)器中Accumulibacter的豐度，視野中大多數(shù)細(xì)菌被標(biāo)記上了熒光，據(jù)此認(rèn)為污泥中Accumulibacter具有較高豐度.然而，鑒于EBPR工藝活性污泥中PAO 具有豐富的遺傳多樣性，當(dāng)上述探針僅定量Accumulibacter屬而不能覆蓋全部PAO 屬時(shí)將嚴(yán)重影響探針的全面性，導(dǎo)致檢測(cè)得到的PAO 豐度結(jié)果存在被低估的可能性.

表1 EBPR 工藝活性污泥PAO 豐度檢測(cè)常用探針及序列Table 1 Common probes and sequences labeling PAO in EBPR process

以高通量測(cè)序或變性梯度凝膠電泳技術(shù)為手段的活性污泥PAO 豐度檢測(cè)方法，通?；赑AO 所在屬的豐度來(lái)推測(cè)活性污泥中PAO 總豐度.例如，Islam 等[35]采用高通量測(cè)序技術(shù)在側(cè)向流缺氧-好氧-厭氧處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了Candidatus accumulibacter、Tetrasphaera、Rhodocyclus和Dechloromonas等屬，比較這些屬的豐度水平后認(rèn)為PAO 以γ 與β 變形菌綱為主.Dong 等[36]采用高通量技術(shù)在處理城市污水的厭氧-好氧-缺氧SBR 反應(yīng)器中檢測(cè)到Candidatus accumulibacter、Bacillus及Pseudomonas等屬，根據(jù)各屬豐度的變化情況，推測(cè)添加三氯苯氧氯酚導(dǎo)致PAO 豐度下降.然而，這種基于PAO 所在屬的豐度來(lái)推測(cè)活性污泥中PAO 總豐度的研究結(jié)果存在較大的不確定性.例如，研究表明Acinetobacter junii是一種PAO[37]，而同屬的Acinetobacter seohaensis卻不能完成超量聚P 過(guò)程[38]，在這種情況下，以這兩株菌所在屬的豐度作為該屬PAO 豐度時(shí)其結(jié)果存在高估的可能性.另外，由該文總結(jié)的EBPR 工藝活性污泥PAO 多樣性結(jié)果可以看出，幾乎所有依托高通量測(cè)序或變性梯度凝膠電泳技術(shù)結(jié)果總結(jié)PAO 總豐度時(shí)，其所參考的PAO 屬類型嚴(yán)重不足，在這種情況下得到的活性污泥PAO 總豐度結(jié)果還存在被低估的可能性.

酶是PAO 生物聚磷反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，包括多聚磷酸鹽激酶(PPK)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAP)、外切聚磷酸酶(PPX)和內(nèi)切聚磷酸酶(PPN)在內(nèi)的多種酶共同參與并調(diào)控了胞內(nèi)Poly-P 的合成和分解代謝[39]，其中PPK 酶可細(xì)分為PPK1、PPK2、PPK3 和PPK4 酶(PPK4 存在于真菌中[40]，該文不作為重點(diǎn))等4 種類型[41].PAP〔以Poly-P 作供體，將腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷(ADP)[42]，見(jiàn)式(1)〕、PPX〔釋放Poly-P 鏈末端的磷酸基團(tuán)，同時(shí)釋放出能量[43]，見(jiàn)式(2)〕、PPN〔催化長(zhǎng)鏈Poly-P 逐步裂解生成大量的短鏈Poly-P[44]，見(jiàn)式(3)〕、PPK2〔以Poly-P 作為磷酸基團(tuán)供體將二磷酸鳥苷(GDP)合成三磷酸鳥苷(GTP)[45]，見(jiàn)式(4)〕、PPK3〔以Poly-P 作為磷酸基團(tuán)供體將二磷酸胞苷(CDP)轉(zhuǎn)化為三磷酸胞苷(CTP)[46]，見(jiàn)式(5)〕均參與Poly-P 降解反應(yīng).只有PPK1 是胞內(nèi)Poly-P 合成的關(guān)鍵酶，它催化三磷酸腺苷(ATP)末端的磷酸基團(tuán)可逆地轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)鏈Poly-P 上，形成長(zhǎng)度更長(zhǎng)的正磷酸鹽線狀或環(huán)狀多聚物[47]，如式(6)所示.

式中，ARP(F)為球狀肌動(dòng)蛋白，ARP(G)為絲狀肌動(dòng)蛋白.

PPK 酶由ppk功能基因編碼，根據(jù)PPK 酶分型ppk基因同樣可分為ppk1、ppk2、ppk3及ppk4共4種類型，針對(duì)這些功能基因設(shè)計(jì)特異性、通用性引物是開展定量PCR 檢測(cè)PAO 豐度的基礎(chǔ).早在20 世紀(jì)90 年代，研究者們分別克隆和分析Klebsiellasp.[48]、Pseudomonassp.[49]和Acinetobactersp.[50]等細(xì)菌的ppk基因.在Web of Science上分別以“ppk1”“ppk2”“ppk3”及“ppk4”進(jìn)行標(biāo)題、摘要和關(guān)鍵詞的合并檢索，截至2021 年筆者檢索到的文章數(shù)量分別為154、92、8 和4 篇，表明關(guān)注點(diǎn)主要焦聚在ppk1基因上，同時(shí)超過(guò)80%的ppk1引物應(yīng)用僅僅針對(duì)Accumulibacter屬ppk1基因，被用來(lái)研究EBPR 工藝Accumulibacter屬的群落結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)(如Accumulibacter各進(jìn)化枝的豐度和類型)[35,51-52]，相比而言，針對(duì)所有PAO 的ppk1基因的通用性、特異性引物則較為少見(jiàn)(見(jiàn)表2).這些針對(duì)Accumulibacter屬ppk1基因的特異性引物將該屬細(xì)菌劃分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型又分為ⅠA、ⅠB、ⅠC、ⅠD 和ⅠE 支系，Ⅱ型則包括ⅡA、ⅡB、ⅡC、ⅡD、ⅡE、95ⅡF、ⅡG、ⅡH 和Ⅱ-Ⅰ，共14 個(gè)進(jìn)化枝[52].其中，引物對(duì)Acc-ppk1-254f 和Acc-ppk1-1376r由Mcmahon 等[53]于2007 年設(shè)計(jì)，它能擴(kuò)增出1 123 bp 基因片段，而He 等[54]于2007 年針對(duì)Acc-Ⅰ、Acc-ⅡA、Acc-ⅡB、Acc-ⅡC 以及Acc-ⅡD 等進(jìn)化枝分別設(shè)計(jì)的引物對(duì)成為目前研究與應(yīng)用最多的引物對(duì).如Zeng 等[51]利用引物對(duì)Acc-ppk1-254f 和Accppk1-1376r 調(diào)查了3 個(gè)污水處理廠活性污泥中Candidatus accumulibacter的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Candidatus accumulibacter在A2O 系統(tǒng)中占全部微生物的26%，且冬季豐度顯著高于夏季；進(jìn)一步對(duì)Accumulibacter各進(jìn)化枝引物對(duì)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所有系統(tǒng)中Acc-Ⅱ型占據(jù)顯著優(yōu)勢(shì)，豐度達(dá)到2.59×109cells/(g MLSS)，占Accumulibacter總量的87.3%.然而，如第2 節(jié)所述，活性污泥中PAO 具有豐富的遺傳多樣性，在此情況下，僅僅以Accumulibacter屬為研究對(duì)象存在不全面的問(wèn)題.

表2 活性污泥PAO 的ppk1 基因常用引物及序列Table 2 Common amplification primer pairs and sequences targeting ppk1 gene

與Accumulibacter屬ppk1基因引物設(shè)計(jì)和應(yīng)用現(xiàn)狀相比，針對(duì)活性污泥中PAO 多樣性設(shè)計(jì)的ppk1基因通用引物的研究工作相對(duì)較少，影響力也不足.2002 年Mcmahon 等基于12 個(gè)PPK1 酶的氨基酸序列開展了ppk1基因通用引物的設(shè)計(jì)，這對(duì)引物被命名為NLDE 和TGNY，它能夠擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1 300 bp的ppk1片段[55]，在不同城市污水處理廠的活性污泥樣品檢測(cè)中只獲得了少數(shù)幾種PAO 基因信息[56].2009 年Mehlig 等[56]根據(jù)NCBI 中Ralstonia eutropha(AAZ65185)、Neisseria meningitidis(CAB83848)、Acinetobactersp.(CAA86935)、Propionibacterium acnes(YP_055056)、Nocardia farcinica(BAD59057)和Brucella abortus(YP_221494)的PPK1 酶氨基酸序列設(shè)計(jì)了引物對(duì)ppk1-FW 和ppk1-RW，該引物對(duì)可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1 100 bp 的基因片段，相較于NLDE和TGNY 引物對(duì)能夠檢測(cè)到更多的ppk1序列.該文的調(diào)研結(jié)果顯示，這兩種引物設(shè)計(jì)時(shí)并未全面覆蓋活性污泥PAO 多樣性，其特異性和通用性均尚待驗(yàn)證.然而，除此之外，尚未見(jiàn)到其他ppk1基因通用引物的研究.因此，以EBPR 工藝活性污泥PAO 多樣性為依據(jù)，開展以ppk1基因的新通用引物設(shè)計(jì)研究具有十分重要的理論與實(shí)際意義.

3.2 胞內(nèi)Poly-P 含量檢測(cè)方法

某些特定的染色劑，如4',6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)[57]、奈氏試劑(neisser)[58]、亞甲基藍(lán)(methylene blue)[59]、鹽酸四環(huán)素[60]等，能夠與胞內(nèi)Poly-P 發(fā)生選擇性反應(yīng)，從而可以直接觀測(cè)到染色后的胞內(nèi)Poly-P.由于染色法簡(jiǎn)便易行，通常被用于胞內(nèi)Poly-P 的定性分析，其中DAPI 應(yīng)用最為廣泛，其結(jié)果可作為定量結(jié)果的參考.已有研究顯示，采用電子能量損失譜和核磁共振技術(shù)，分析細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)與元素組成信息，也觀察到了Poly-P 顆粒[61]，但應(yīng)用較少.

調(diào)研表明，以非PAO 為主的活性污泥中磷含量一般為污泥干質(zhì)量的1.5%～2%[62]，而EBPR 工藝中污泥磷含量可以達(dá)到污泥干質(zhì)量的4%～8%，在某些情況下甚至可以達(dá)到10%～15%[10].污泥磷含量可以一定程度上反映出系統(tǒng)的吸磷能力，但是并不能直接反映PAO 對(duì)除磷的貢獻(xiàn).相比之下，測(cè)定胞內(nèi)Poly-P含量能夠直接反映PAO 在EBPR 工藝除磷效果上的貢獻(xiàn).傳統(tǒng)的Poly-P 含量分析檢測(cè)手段包括萃取-正-磷分析法[63]、提取純化方法[64]、拉曼光譜[65]、X 射線[66]、凝膠電泳[67]、蛋白質(zhì)親和力[68]以及Poly-P 消耗法[69]等.然而，這些傳統(tǒng)分析方法通常需要復(fù)雜的提取和預(yù)處理過(guò)程，效率不高；加之強(qiáng)酸在消化過(guò)程中的使用，使得所有形態(tài)的磷都可以轉(zhuǎn)化為PO43—，導(dǎo)致Poly-P 含量被高估.Feng 等[70]發(fā)現(xiàn)，pH=8 時(shí)添加1%的EDTA 獲得了最高的PO43—釋放量，Poly-P 含量測(cè)定具有簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為先進(jìn)的胞內(nèi)Poly-P 定量檢測(cè)方法，但該方法以活性污泥作為研究對(duì)象，未區(qū)分PAO 和非PAO 的相關(guān)特征，其準(zhǔn)確性和適用性還有待評(píng)價(jià).

4 結(jié)論與展望

a) EBPR 新機(jī)理.目前還需要持續(xù)開展PAO 新菌株的生理生化研究，探討更多PAO 菌株的厭氧內(nèi)碳源合成特征、厭氧釋磷意義、反硝化聚磷能力等菌株特征，為EBPR 機(jī)理提供更充分、更全面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).另外，在解決PAO 除磷潛力評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，需要加強(qiáng)以工藝試驗(yàn)為基礎(chǔ)的EBPR 機(jī)理的驗(yàn)證研究，包括反硝化除磷、厭氧釋磷的必要性等內(nèi)容，并形成相應(yīng)的操作規(guī)程.

b) PAO 通用引物設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià).應(yīng)基于EBPR 工藝PAO 豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，開展目前PAO 通用引物的通用性和特異性評(píng)價(jià)工作，探討目前PAO 通用引物對(duì)已發(fā)現(xiàn)的42 個(gè)菌屬83 株已定種PAO 菌株的檢測(cè)效果以驗(yàn)證其通用性，并在必要條件下開展PAO 新通用引物的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)EBPR工藝中活性污泥PAO 除磷潛力提供有效的檢測(cè)手段.

c) 胞內(nèi)Poly-P 含量EDTA 檢測(cè)方法校準(zhǔn).應(yīng)以非PAO 菌株為對(duì)照(不是活性污泥)，采用EDTA 定量檢測(cè)方法，檢測(cè)到PAO 菌株在攝磷過(guò)程中無(wú)Poly-P顆粒、有Poly-P 顆粒，但無(wú)法染色觀察、清楚觀察到Poly-P 顆粒等臨界條件下胞內(nèi)Poly-P 和TP 的含量，為該檢測(cè)方法提供可供參考的邊界數(shù)據(jù).