基于線蟲生物多樣性的稻田鎘污染土壤修復(fù)成效研究

鄧普榮，姚 志，劉勇波

中國環(huán)境科學研究院，國家環(huán)境保護區(qū)域生態(tài)過程與功能評估重點實驗室，北京 100012

近年來，農(nóng)田土壤重金屬污染問題備受關(guān)注.農(nóng)田的重金屬積累使得土壤肥力下降、土壤退化和可利用耕地面積減少[1-2]，且受污染農(nóng)田的重金屬通過食物鏈在植物、動物和人體內(nèi)富集，威脅人體健康[3].為修復(fù)重金屬污染的耕地，已采用物理、化學、生物和農(nóng)業(yè)生態(tài)修復(fù)等技術(shù)方法，如客土法、熱解吸法、土壤淋洗、植物和微生物修復(fù)、調(diào)整農(nóng)田耕作制度等一系列農(nóng)田重金屬修復(fù)技術(shù)[4-5].通過施用鈍化劑吸附、沉淀或絡(luò)合重金屬被廣泛用于農(nóng)田重金屬的修復(fù)，降低重金屬的流動性和生物利用率，從而減少重金屬在食物鏈上的傳遞[6].

土壤重金屬污染的修復(fù)技術(shù)發(fā)展日漸成熟，但對受污染農(nóng)田的修復(fù)后評價，特別是針對土壤動物的群落特征及種群動態(tài)的監(jiān)測常常被忽視[7].20 世紀80年代，荷蘭線蟲學家Bongers[8]將土壤線蟲作為環(huán)境指示生物應(yīng)用到污染土壤監(jiān)測及恢復(fù)過程中.土壤線蟲是土壤動物的一個重要類群，其種類繁多，分布廣泛，參與土壤中有機質(zhì)分解、植物營養(yǎng)礦化和養(yǎng)分循環(huán)等生態(tài)過程，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位[9-10].土壤線蟲的物種多樣性、食性多樣性和生活史策略多樣性使其在變動的環(huán)境因子中，尤其是污染脅迫中作出迅速反應(yīng)[11-12].土壤線蟲不同營養(yǎng)類群的組成、數(shù)量及線蟲群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)分析可直接反映土壤物質(zhì)的代謝途徑和食物鏈/食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的變化，指示土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量的流動情況，進而在生態(tài)系統(tǒng)功能水平上揭示土壤環(huán)境健康狀態(tài)[13-16].

該文在鎘污染稻田土壤中采用施加鈍化劑、鈍化劑+凈水和噴施葉面肥三種修復(fù)措施，分析水稻農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤線蟲的物種組成、豐富度、群落結(jié)構(gòu)、食物網(wǎng)動態(tài)及群落的結(jié)構(gòu)變化，評價修復(fù)措施對Cd 污染稻田土壤修復(fù)的生態(tài)效應(yīng)，以期確定能否采用土壤線蟲多樣性指數(shù)來指示農(nóng)田重金屬污染的修復(fù)成效.

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖南省長沙市長沙縣農(nóng)田(28°15′N、113°14′E)，占地面積約0.37 hm2.表層土壤中Cd 的濃度范圍為0.40～0.80 mg/kg，超過《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 15618—2018)農(nóng)用地土壤Cd 污染風險篩選值(0.4 mg/kg)，而其他重金屬含量均低于GB 15618—2018 相關(guān)限值.

試驗田種植了早稻“中早39”和晚稻“玉針香”，水稻種子由湖南省農(nóng)業(yè)科學院提供.育苗前用5%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，用自來水沖洗.稻田其他管理遵循長沙縣當?shù)厮境Ｒ?guī)操作流程.

1.2 土壤修復(fù)技術(shù)與線蟲取樣方法

該試驗采用3 種土壤修復(fù)方法，即施用鈍化劑、鈍化劑+凈水、噴施葉面肥[17].鈍化劑的主要成分是赤泥、磷礦粉、海泡石，三者質(zhì)量比為2∶1∶1；使用時按1 kg 農(nóng)田土添加2 g 鈍化劑(包括赤泥0.10%、磷礦粉0.05%、海泡石0.05%)，即鈍化劑含量為0.2%；以1 hm2農(nóng)田施用300 kg 鈍化劑的比例向農(nóng)田中施用鈍化劑.葉面肥中1.0 g/L 的硅來自Na2SiO3，0.5 g/L的磷來自NaH2PO4，1.5 g/L 的硒來自Na2SeO3，0.5 g/L的硫來自Na2S，0.5 g/L 鎂的來自MgCl2.3 種土壤修復(fù)方法分別在3 塊農(nóng)田中進行，并設(shè)置蒸餾水噴施作為對照組(CK)，共4 種處理，每種處理均設(shè)3 個重復(fù)地塊，地塊面積40～135 m2.在水稻種植的苗期(25～35 d)、分蘗期(60～70 d)和開花期(80～90 d)分別施用鈍化劑和噴施葉面肥.

于5 月22 日、7 月16 日、9 月23 日和10 月22 日在長沙縣試驗地收集土壤樣品，為隨機取樣.每次在各地塊中的3 個樣點采集3 份重復(fù)土壤，取樣深度為0～30 cm.利用重糖離心法分離土壤線蟲，稱取100 g土樣，放入1 000 mL 燒杯內(nèi)，加水至300 mL，浸泡30 min；過60 目(0.25 mm)、100 目(0.15 mm)和500 目(0.025 mm)篩，收集篩上的線蟲和卵，倒入離心管中離心(分離線蟲，3 000 r/min，離心5 min；分離卵，3 000 r/min，離心3 min)；把上清液倒掉，加蔗糖(分離線蟲加70%的蔗糖液，分離卵加35%～40%的蔗糖)，離心(同上)，過500 目(0.025 mm)篩，收集篩上的線蟲和卵，在解剖鏡下記數(shù)并鑒定到屬[18].

1.3 生物多樣性指數(shù)和生態(tài)功能性指數(shù)計算

1.3.1 土壤線蟲生物多樣性指數(shù)

物種多樣性指數(shù)選用多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù).

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H′)：

Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)(C)：

Pielou 均勻度指數(shù)(E)：

SR 豐富度指數(shù)：

式中，Pi為第i種線蟲的個體數(shù)占調(diào)查個體總數(shù)的比例，N為所調(diào)查到的總個體數(shù)，S為所調(diào)查的物種總數(shù).

1.3.2 土壤線蟲生態(tài)功能性指數(shù)

生態(tài)功能指數(shù)選用成熟指數(shù)(MI 指數(shù))、植物寄生線蟲成熟指數(shù)(PPI 指數(shù))、線蟲富集指數(shù)(EI 指數(shù))、線蟲結(jié)構(gòu)指數(shù)(SI 指數(shù))、線蟲通路比值(NCR 值)和瓦斯樂斯卡指數(shù)(WI 指數(shù)).

MI 指數(shù)：

式中，Cpi為第i種線蟲的c-p 值(colonizer-persister value)，c-p 值根據(jù)自由生活線蟲在生態(tài)演替中的不同生活策略，分別賦值為1～5.根據(jù)線蟲在r 對策到k 對策的生活史策略連續(xù)譜中的位置，將線蟲劃分為5 個c-p 類群：c-p 1 為典型的機會主義者，世代時間極短，卵量巨大，在食物豐富的條件下種群暴發(fā)，極耐污染和環(huán)境壓力；c-p 2 也是機會主義者，世代時間短，卵量大，較耐污染和環(huán)境壓力；c-p 3 世代時間較長，對環(huán)境壓力較敏感；c-p 4 世代時間長，對環(huán)境壓力敏感；c-p 5 則為典型的k 對策者，世代時間很長，卵量小，對污染和環(huán)境壓力極為敏感[8,19].

PPI 指數(shù)：

式中，Pi′為植物寄生性線蟲在線蟲種群中的占比，m為所調(diào)查植物寄生性線蟲的物種總數(shù).

MI 指數(shù)和PPI 指數(shù)反映土壤線蟲群落功能結(jié)構(gòu)特征，用以評價人類干擾活動對土壤線蟲群落的影響，MI 指數(shù)反映自由生活線蟲的成熟度，PPI 指數(shù)反映植物寄生線蟲的成熟度，較低的MI 指數(shù)表明土壤生態(tài)系統(tǒng)擾動強烈，反之則表明土壤生態(tài)系統(tǒng)趨于穩(wěn)定.

MI25 指數(shù)：

式中，Cpi25為c-p 值在2～5 之間的第i種線蟲的c-p值，Pi25為第i種線蟲的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例，MI25 為c-p 值在2～5 之間的自由生活線蟲的總成熟指數(shù)，n為c-p 值在2～5 之間線蟲的物種總數(shù).

EI 指數(shù)：

式中：EI 代表土壤線蟲富集指數(shù)；根據(jù)線蟲食性并結(jié)合線蟲生活史特征，將線蟲分為若干類群〔Bax、Fux、Ppx和Omx分別代表食細菌、食真菌、植食性以及雜食/捕食線蟲(x取值為1～5，代表線蟲的c-p 值)[20]〕，b代表食物網(wǎng)中的基礎(chǔ)成分，主要指Ba2和Fu2這兩個類群；e代表食物網(wǎng)中的富集成分，主要指Ba1和Fu2這兩個類群；kb和ke為各類群所對應(yīng)的加權(quán)數(shù)(在0.8～5.0 之間)；nb和ne則為各類群的豐度.

SI 指數(shù)：

式中：SI 為結(jié)構(gòu)指數(shù)；s代表食物網(wǎng)中的結(jié)構(gòu)成分，包括Ba3～Ba5、Fu3～Fu5、Om3～Om5和Pp2～Pp5類群；ks為各類群所對應(yīng)的加權(quán)數(shù)；ns為各類群的豐度.

NCR 值：

式中：NBa為食細菌線蟲數(shù)量，個；NFu為食真菌線蟲數(shù)量，個.

WI 指數(shù)：

式中，NPp為植食性線蟲數(shù)量，個.

EI 指數(shù)和SI 指數(shù)均在0～100 之間變化，二者結(jié)合分析可以較好地指示土壤環(huán)境的干擾程度和土壤食物網(wǎng)的變化.EI 指數(shù)主要用于評估食物網(wǎng)對可利用資源的響應(yīng)，SI 指數(shù)指示在干擾或恢復(fù)過程中土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的變化.NCR 值主要用于指示土壤食物網(wǎng)的降解途徑[14].

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤線蟲群落組成

土壤線蟲分析數(shù)據(jù)如表1 所示，共鑒定出線蟲13 599 條，隸屬于32 屬，包括食細菌線蟲13 屬，占14.62%；食真菌線蟲3 屬，占1.72%；植食性線蟲8 屬，占22.10%；雜食/捕食線蟲8 屬，占61.55%.矛線屬(Dorylaimus)、潛根屬(Hirschmanniella)和托布利屬(Tobrilus)為此水稻農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢屬.

表1 試驗稻田樣地土壤線蟲群落組成Table 1 Community composition of soil nematode in paddy fields

2.2 Cd污染土壤修復(fù)措施下線蟲群落多樣性的變化

土壤線蟲的豐富度、物種數(shù)、生物多樣性指數(shù)等在不同取樣時間表現(xiàn)出顯著差異(見表2).不同修復(fù)措施對水稻土壤線蟲物種數(shù)、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)和SR 豐富度指數(shù)均沒有顯著影響，但對土壤線蟲豐富度有顯著影響(P＜0.05，見表2、圖1、圖2).

表2 3 種修復(fù)措施下稻田土壤線蟲的生物多樣性指數(shù)方差分析結(jié)果Table 2 F-values of ANOVAs for biodiversity indices of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

線蟲豐富度的影響與取樣時間有交互作用(見表2).多重比較分析不同月份3 種土壤修復(fù)措施下稻田土壤中線蟲豐富度發(fā)現(xiàn)，在9 月和10 月線蟲豐富度差異不顯著，但在5 月和7 月差異顯著(見圖1).5 月，鈍化劑處理的土壤中線蟲豐富度最高，顯著高于鈍化劑+凈水和葉面肥處理，但與對照組沒有顯著性差異.7 月，葉面肥處理的水稻土壤中線蟲豐富度最高，顯著高于鈍化劑處理的水稻土壤，但與鈍化劑+凈水處理和對照組差異不顯著(見圖1).

2.3 Cd 污染土壤修復(fù)措施下土壤線蟲生活史策略指數(shù)的變化

不同修復(fù)措施對水稻農(nóng)田土壤線蟲生活史策略指數(shù)—MI 指數(shù)、PPI 指數(shù)、MI25 指數(shù)等均有顯著影響(見表3).土壤線蟲MI 指數(shù)在不同處理之間有顯著性差異(見表3)，多重比較分析發(fā)現(xiàn)，在5 月和9 月沒有顯著差異，但在7 月和10 月有顯著差異，其中鈍化劑+凈水處理的土壤中線蟲MI 指數(shù)最高，顯著高于葉面肥處理的土壤，但與鈍化劑處理和對照組的土壤均無顯著差異(見圖3).

表3 3 種修復(fù)措施下稻田土壤線蟲的生活史策略指數(shù)方差分析結(jié)果Table 3 F-values of ANOVAs for life history strategy indices of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

植物寄生線蟲PPI 指數(shù)在不同處理之間具有顯著差異(見表3)，多重比較分析發(fā)現(xiàn)，在5 月、9 月和10 月差異不顯著，但在7 月有顯著差異(見圖3).7 月，葉面肥處理的土壤中線蟲PPI 指數(shù)顯著低于鈍化劑+凈水處理的土壤，但與鈍化劑處理和對照組的土壤均無顯著差異(見圖3).

由圖3 可見：5 月，使用鈍化劑處理的土壤中線蟲MI 指數(shù)最低，顯著低于對照組土壤，但與鈍化劑+凈水及葉面肥處理的土壤之間沒有顯著差異；7 月和10 月，葉面肥處理的土壤中線蟲MI 指數(shù)最低，顯著低于鈍化劑+凈水處理的土壤，但與對照組和鈍化劑處理的土壤均無顯著差異(見圖3).

c-p 值在2～5 之間的自由生活線蟲成熟指數(shù)(MI25 指數(shù))能指示土壤狀況的變化.由圖3 可見，在7 月和10 月，不同處理間稻田土壤線蟲群落MI25 指數(shù)有顯著差異，但在5 月和9 月無顯著差異.在7 月和10 月，葉面肥處理的土壤中線蟲MI25 指數(shù)最低，顯著低于鈍化劑+凈水處理的土壤，但與對照組及鈍化劑處理的土壤均沒有顯著差異.

2.4 Cd 污染土壤修復(fù)措施下線蟲生態(tài)功能指數(shù)的變化特征

不同土壤修復(fù)措施下線蟲的生態(tài)功能指數(shù)(EI指數(shù)、SI 指數(shù)、NCR 指數(shù)和WI 指數(shù))均沒有顯著差異(見表4 和圖4).NCR 指數(shù)接近0，代表土壤有機質(zhì)分解依靠真菌分解途徑；若NCR 指數(shù)接近1，代表土壤有機質(zhì)分解依賴細菌分解途徑[21].所有樣地的NCR 指數(shù)在0.6～1.0 之間，表明細菌是農(nóng)田土壤有機質(zhì)的主要分解分解者.該農(nóng)田多數(shù)土壤樣品的WI 指數(shù)＞1，表明土壤健康程度較好.

表4 3 種修復(fù)措施下稻田土壤線蟲的生態(tài)功能性指數(shù)方差分析結(jié)果Table 4 F-values of ANOVAs for ecological functions of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

EI 指數(shù)與SI 指數(shù)聯(lián)合使用時，以SI 指數(shù)(0～100)為橫坐標、EI 指數(shù)(0～100)為縱坐標，以(50，50)為中心，將SI 指數(shù)和EI 指數(shù)的分布劃分成4 個象限，這4 個象限分別代表食物網(wǎng)不同的特征.SI 指數(shù)指示土壤食物網(wǎng)連通性和食物鏈長度，其數(shù)值越大，表明相對連通性越高，食物鏈越長.EI 指數(shù)指示外界養(yǎng)分投入狀況，其數(shù)值越大，表明外界投入養(yǎng)分相對越多.由圖5 可見，在3 種稻田重金屬Cd 的修復(fù)措施下，各處理的土壤線蟲權(quán)重區(qū)系分析結(jié)果分布于B 和C 象限.分布于B 象限表明該水稻農(nóng)田養(yǎng)分狀況較好且受脅迫程度較低，食物網(wǎng)穩(wěn)定成熟；分布在C 象限表明水稻農(nóng)田肥力狀況較差但受脅迫程度較低[22].

2.5 討論

土壤線蟲食性多樣，占據(jù)食物鏈/食物網(wǎng)多個營養(yǎng)級，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分.土壤線蟲因種類眾多、繁殖力強、遷移能力差和對環(huán)境脅迫敏感，常作為評價土壤質(zhì)量的指示生物[23-24].筆者試驗研究了Cd 污染稻田在3 種修復(fù)措施下，土壤線蟲的多樣性及土壤線蟲群落的結(jié)構(gòu)和功能的變化，發(fā)現(xiàn)土壤線蟲的豐富度、物種數(shù)、生物多樣性指數(shù)和生態(tài)功能指數(shù)等在不同取樣時間上有顯著性差異.Yang等[25]對連續(xù)種植多年的轉(zhuǎn)Bt基因水稻農(nóng)田觀測發(fā)現(xiàn)，取樣年份和采樣日期對根際土壤中線蟲群落組成的影響比轉(zhuǎn)Bt基因水稻處理更明顯.這也證明土壤線蟲隨環(huán)境因子變化而變化，適合指示土壤理化性質(zhì)、土壤肥力、土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能等動態(tài)變化[19,26].一般采用多種物理、化學和生物技術(shù)方法修復(fù)重金屬Cd 污染土壤，如使用鈍化劑和葉面肥等，這些可能改變土壤環(huán)境，從而影響土壤線蟲群落.鈍化劑通過升高稻田土壤pH 從而降低重金屬Cd 從土壤到水稻的遷移率[27]，也能影響農(nóng)田中線蟲的群落結(jié)構(gòu)和動態(tài)[28].噴施混合磷硫葉面肥影響地上部分作物的次生代謝產(chǎn)物進而影響土壤線蟲群落[17].

鈍化劑和鈍化劑+凈水的噴施均顯著增加了稻田線蟲成熟指數(shù)，且c-p 3、c-p 4、c-p 5 的線蟲類群占據(jù)優(yōu)勢，該措施下農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)受到的干擾減小，向著更成熟的階段發(fā)展.葉面肥噴施處理部分降低了土壤線蟲的MI 指數(shù)，增加了PPI 指數(shù)，且c-p 2～5 類群線蟲的MI25 指數(shù)為所有處理間最低，這說明地上植被與土壤線蟲群落之間為聯(lián)動的系統(tǒng).植被-土壤-土壤線蟲之間存在的互動效應(yīng)[29].Zhang 等[30]以森林生態(tài)系統(tǒng)為例，證明森林地上植被的種群結(jié)構(gòu)會影響地下土壤線蟲多樣性和種群結(jié)構(gòu)的維持.Hu 等[31]以高山草甸生態(tài)系統(tǒng)為例，證明放牧強度對土壤線蟲群落有顯著影響.葉面肥的噴施一定程度上促進了農(nóng)田地上水稻作物的生長，進而影響了土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)[32].在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，地上部分農(nóng)作物的耕作也影響著土壤線蟲的豐度.在試驗中隨著水稻的收獲，土壤線蟲豐度于7 月和10 月達到了峰值.水稻的收獲使有機質(zhì)在稻田土壤中積累，特別是在7 月，土壤線蟲豐富度、物種數(shù)和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)均達到峰值.Zhu 等[32-34]證明，適量的有機肥或秸稈還田都增加了土壤線蟲的多樣性，改變了土壤線蟲群落的組成.

3 種修復(fù)措施對水稻土壤線蟲的生態(tài)功能指數(shù)均沒有顯著影響.Park 等[35]對0～2.6 mg/kg 濃度梯度下Cd 污染土壤的短期生態(tài)效應(yīng)評估發(fā)現(xiàn)，Cd 對生態(tài)指數(shù)影響顯著，這可能與土壤Cd 的含量相關(guān).但在試驗中鈍化劑和葉面肥的使用導致線蟲NCR 指數(shù)降低，有機物分解途徑向真菌分解轉(zhuǎn)移，而WI 指數(shù)增加，土壤健康狀況向好發(fā)展[36].氮和磷的有效性限制了生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力，土壤養(yǎng)分的有效性和碳氮比是稻田土壤線蟲群落的主要調(diào)控因子[9,36].這種養(yǎng)分驅(qū)動對土壤微生物和線蟲的影響可能超過了重金屬有效性的負面影響[34,36].

土壤管控模式影響了土壤線蟲群落種群動態(tài).例如，農(nóng)田耕作方式、土壤有機肥使用和殺蟲劑噴施等均會對土壤線蟲群落多樣性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[37-43].在使用土壤鈍化劑的農(nóng)田管理模式下，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)趨于穩(wěn)定，且土壤健康狀況得到改善，因此鈍化劑可用于微量Cd 重金屬超標稻田管控[5].土壤線蟲群落動態(tài)研究對監(jiān)測農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、改善農(nóng)田營養(yǎng)結(jié)構(gòu)、提高人類干預(yù)恢復(fù)和保護耕地具有重要意義.

3 結(jié)論

a) 土壤線蟲的豐富度、物種數(shù)、生物多樣性指數(shù)和生態(tài)功能指數(shù)等在不同時間有顯著性差異，說明土壤線蟲對環(huán)境因素較敏感，適合用于指示土壤理化性質(zhì)、土壤肥力、土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能等變化.

b) 3 種修復(fù)措施對水稻土壤線蟲豐富度有顯著影響，不同試驗處理對水稻土壤線蟲Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)的影響與取樣時間有交互作用.

c) 3 種修復(fù)措施對水稻土壤線蟲的生態(tài)功能指數(shù)—EI 指數(shù)、SI 指數(shù)、NCR 值和WI 指數(shù)均沒有顯著影響，說明這3 種重金屬土壤修復(fù)措施對土壤線蟲群落的結(jié)構(gòu)和功能沒有顯著影響.

d) Cd 污染修復(fù)措施對水稻土壤線蟲生活史策略指數(shù)系列(MI 指數(shù)、PPI 指數(shù)、MI25 指數(shù)等)有顯著影響.MI 系列指數(shù)為線蟲群落的加權(quán)c-p 值，較好地指示了土壤生態(tài)系統(tǒng)的演替和恢復(fù)等過程，說明土壤重金屬修復(fù)模式顯著影響了土壤線蟲群落的生態(tài)系統(tǒng)演替.土壤線蟲生活史策略指數(shù)可以作為重金屬污染土壤修復(fù)的成效評價指標.