肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比例聯(lián)合革蘭染色對肺炎的診斷效能研究

盛夢秋 張玉 張淇瑋 張鑫強(qiáng) 侯鐵英，

1廣東省人民醫(yī)學(xué)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣東省心血管病研究所，廣東省臨床檢驗(yàn)中心（廣州510120）；廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）2檢驗(yàn)科，3醫(yī)務(wù)處（廣州 510120）

肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，根據(jù)獲得環(huán)境，可分為社區(qū)獲得性肺炎（communityacquired pneumonia，CAP）和醫(yī)院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）［1］。HAP 是我國最常見的醫(yī)院獲得性感染，診斷治療較為困難，病死率高［2-3］。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2010-2019年下呼吸道感染已成為感染性疾病中死亡人數(shù)最多的疾病，盡管死亡總?cè)藬?shù)有減少［4］。肺炎常用的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法為涂片革蘭染色鏡檢和病原微生物培養(yǎng)［5］。臨床上肺炎送檢標(biāo)本多為痰標(biāo)本，但痰標(biāo)本的采集多出現(xiàn)被口腔內(nèi)細(xì)菌污染的情況，革蘭染色鏡檢無法區(qū)分病原體是定植或感染，培養(yǎng)所需時(shí)間較長，且二者陽性率均不高。支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）污染率較低，并且病原菌檢出率高于痰液、血液［6-7］。WALTER 等［8］發(fā)現(xiàn)BALF 中性粒細(xì)胞比例下降50%對危重細(xì)菌性肺炎的患者陰性預(yù)測效能高達(dá)90%。也有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道樣本革蘭染色（gram staining）有助于呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）的早期診斷，指導(dǎo)抗生素使用［9-10］。但目前BALF 中性粒細(xì)胞比例對肺炎診斷尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。本研究回顧性分析肺炎患者肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比例，聯(lián)合革蘭染色對肺炎進(jìn)行診斷，并對其診斷效能進(jìn)行評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入2018年9月至2021年5月期間在廣東省人民醫(yī)院氣管鏡室送檢呼吸內(nèi)科BALF 標(biāo)本的住院患者。共188 例患者納入研究，肺炎患者108 例為實(shí)驗(yàn)組，非肺炎患者80 例為對照組，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例。通過醫(yī)院信息系統(tǒng)（hospital information system，HIS）、實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（laboratory information management system，LIS）對患者的人口學(xué)特征、臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行查詢，收集患者人口學(xué)特征、出入院診斷、抗生素使用、住院天數(shù)、臨床診斷、疾病轉(zhuǎn)歸、患者BALF 中性粒細(xì)胞比例、BALF革蘭染色等臨床信息和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 分組和方法 入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18 歲；（2）行支氣管鏡留取BALF 標(biāo)本送檢的住院患者，（3）臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果一致。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）BALF 不合格標(biāo)本≤5 mL；（2）患者病例資料不全。依據(jù)CAP 和HAP 診斷和治療指南［4，11］，結(jié)合臨床診斷，將患者分為肺炎組和非肺炎組。肺炎組包括CAP 和HAP 患者，非肺炎包括非病原菌感染的肺部疾病，如肺癌、肺結(jié)節(jié)、慢性阻塞性肺病等行支氣管肺泡灌洗的患者。BALF 的實(shí)驗(yàn)室預(yù)處理遵循中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)專家共識(shí)［12］。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)修訂的《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》。CAP 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）社區(qū)發(fā)?。唬?）肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn)：新近出現(xiàn)的咳嗽咳痰或原有呼吸道疾病加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；肺實(shí)變體征和（或）聞及濕啰音；發(fā)熱；外周血白細(xì)胞＞109/L 或＜4 × 109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移；（3）胸部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)的斑片狀浸潤影、葉或段實(shí)變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。符合（1）（3）及（2）中任何一項(xiàng)，并除外其他肺部疾病后，可建立臨床診斷［4］。

依據(jù)2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)感染學(xué)組制定的《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南》。HAP 是指患者住院期間沒有接受有創(chuàng)機(jī)械通氣、未處于病原感染的潛伏期，而于入院48 h 后新發(fā)生的肺炎［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS statistics 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（）表示。采用偏度-峰度檢驗(yàn)法來檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性，并采用分位數(shù)圖（Q-Q plot）來驗(yàn)證。若該資料服從正態(tài)分布，則使用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)（Mann-WhitneyUtest）。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)或者Fisher 確切概率法。制作ROC曲線，通過曲線下面積（area under curve，AUC）對指標(biāo)診斷效能進(jìn)行分析，采用logistic 回歸分析制作BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)聯(lián)合鏡下染色鑒別診斷肺炎和非肺炎的ROC 曲線，靈敏度和特異度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況 本次共收集肺炎患者108 例，非肺炎患者80 例。肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34例；80 例革蘭染色鏡下可見病原菌。兩組患者的年齡、性別等資料進(jìn)行比較，肺炎患者中男性比例較高（P＜0.001），BALF 中性粒細(xì)胞比例肺炎組明顯高于非肺炎組（P＜0.01），革蘭染色結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 患者臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

表1 患者臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

注：a 鏡下可見病原菌

年齡（歲）男性［例（%）］住院天數(shù)（d）使用抗生素［例（%）］BALF中性粒細(xì)胞比例（%）革蘭染色a（%）好轉(zhuǎn)［例（%）］肺炎（n=108例）64±15 83（76.9）13±10 92（85.2）73.75±42.05 80 87（80.6）非肺炎（n=80例）63±17 36（45.0）10±6 52（65.0）28.85±46.25 0 60（75.0）P值0.296 0.001 0.423 0.072＜0.01 0.001 0.074

2.2 BALF 中性粒細(xì)胞在CAP 患者及HAP 患者中的分布 本實(shí)驗(yàn)CAP 患者74 例，HAP 患者34 例。CAP 組和HAP 組的數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，二者方差不齊，因此采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對兩組樣本進(jìn)行比較，得P＞0.05，CAP 和HAP 患者中BALF中性粒細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒細(xì)胞比例的分析結(jié)果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒細(xì)胞比例的分析結(jié)果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

項(xiàng)目中性粒細(xì)胞（%）CAP（n=74例）71.55±41.78 HAP（n=34例）75.25±50.88 Z值-0.443 P值＞0.05

2.3 ROC 曲線分析

2.3.1 BALF 中性粒細(xì)胞比例鑒別診斷肺炎的ROC 曲線及分析 在鑒別診斷肺炎與非肺炎中，BALF 中性粒細(xì)胞比例AUC 分別是0.728，Cut-off值為41.45，靈敏度為0.750，特異度為0.675。見圖1。

圖1 BALF 中性粒細(xì)胞診斷肺炎R(shí)OC 曲線Fig.1 The ROC curve of BALF neutrophils ratio in diagnosis of pneumonia

2.3.2 BALF 中性粒細(xì)胞比例聯(lián)合革蘭染色鑒別診斷肺炎的ROC 曲線及分析 對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，使用二元logistic 回歸分析，得到logistic 回歸方程的常數(shù)項(xiàng)以及各項(xiàng)系數(shù)，可得回歸方程logit（P）=1.128+0.064 革蘭染色-0.031 中性粒，可得聯(lián)合預(yù)測因子=革蘭染色-中性粒*0.031/0.064。構(gòu)建聯(lián)合因子鑒別診斷肺炎與非肺炎的ROC 曲線，如圖2，AUC 為0.731，Cut-off 值為22.09，靈敏度分別是0.724，特異度為0.703。

圖2 BALF 中性粒細(xì)胞比例聯(lián)合革蘭染色診斷肺炎的ROC 曲線Fig.2 The ROC curve of BALF neutrophil ratio combined with gram stain in diagnosis of pneumonia

2.3.3 BALF 中性粒細(xì)胞不同比例對肺炎的診斷靈敏度、特異度特征 評(píng)價(jià)肺炎患者中不同中性粒細(xì)胞比例靈敏度、特異度特點(diǎn)，中性粒細(xì)胞比例≥20%，特異度為25%，陰性預(yù)測值較高為75%；中性粒細(xì)胞比例≥80%的時(shí)候靈敏度最高為97.4%，特異度最低為11.3%，陽性預(yù)測值較高為80.5%。如表3。

表3 BALF 中性粒細(xì)胞比例對肺炎的診斷靈敏度、特異度特征Tab.3 Sensitivity and specificity of BALF neutrophil ratio in diagnosis of pneumonia

3 討論

肺炎已成為全球感染性疾病死亡的主要原因之一［2］。我國目前尚無成人CAP 發(fā)病率數(shù)據(jù)，僅有年齡構(gòu)成比的研究［3］，CAP 和HAP 的發(fā)病率和死亡率均隨著年齡的增加而升高［4，8］。我國一項(xiàng)大規(guī)模醫(yī)院感染橫斷面研究［11］結(jié)果表明，住院患者醫(yī)院獲得性感染的發(fā)生率為3.22% ～5.22%，其中醫(yī)院獲得性下呼吸道感染率為1.76% ～1.94%。ANGUS 等發(fā)現(xiàn)，肺炎是重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）和非重癥監(jiān)護(hù)室（non-intensive care unit，non-ICU）患者主要的住院死亡原因［13］。我國不同地區(qū)HAP 和CAP 的致病菌分布和耐藥性有很大的區(qū)別，不同程度病原菌耐藥給CAP 和HAP 的治療帶來困難［11］，肺炎診斷的不確定和病因不明易導(dǎo)致未感染患者抗生素的過度使用，增加抗生素的耐藥性。因此，找到快速、有效的肺炎早期診斷指標(biāo)，減少抗生素的過度使用是非常有必要的。

目前常見肺部病原微生物檢測方法有涂片染色鏡檢、培養(yǎng)基培養(yǎng)、血清檢測、核酸檢測和宏基因組二代測序計(jì)數(shù)（metagenomics next generation sequencing，mNGS）等，涂片鏡檢存在一定的漏檢率，培養(yǎng)、核酸檢測和mNGS 的報(bào)告時(shí)間至少需要24 h［14］，都不是快速有效的肺炎診斷治療相關(guān)指標(biāo)，尤其是在重癥患者中，無法快速指導(dǎo)治療方案。有研究者提示細(xì)胞學(xué)檢查在感染性疾病診斷中的重要性［15］在肺部急性炎癥反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞（neutrophils）是最先進(jìn)入肺損傷部位的反應(yīng)細(xì)胞［16］，對鑒別感染有較好的臨床效能［17］，且BALF中3%感染細(xì)胞對肺炎有較高的預(yù)測價(jià)值［18］。有學(xué)者建議肺泡灌洗液檢查與細(xì)胞特殊染色相結(jié)合，可以快速識(shí)別微生物病原體引起的肺炎，及時(shí)指導(dǎo)抗生素治療，降低死亡率［19］。

有研究表明，BALF 中性粒細(xì)胞比例與肺結(jié)節(jié)病、彌漫性肺泡損傷、特發(fā)性肺纖維化、硬皮病等疾病有關(guān)，這些非病原體感染肺部炎癥反應(yīng)疾病均會(huì)導(dǎo)致BALF 中性粒細(xì)胞比例升高［20-21］，由表1可見兩組患者抗生素使用率較高，抗生素的經(jīng)驗(yàn)性使用對BALF 中性粒細(xì)胞比例也有一定的影響，因此BALF 中性粒細(xì)胞比例升高并不能作為診斷肺炎的唯一標(biāo)準(zhǔn)。由表3 可知，肺炎患者中BALF中性粒細(xì)胞比例越高，診斷肺炎的靈敏度越高，陽性預(yù)測值也越高，對肺炎的早期診斷、早期治療、改善預(yù)后有更大的意義。

本研究回顧性納入了188 例呼吸內(nèi)科住院患者，其中肺炎診斷108 例，非肺炎診斷80 例，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例，分析發(fā)現(xiàn)肺炎組患者BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非肺炎患者（P＜0.01），但在CAP 和HAP 患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過ROC 曲線分析，BALF 中性粒細(xì)胞比例鑒別診斷肺炎和非肺炎的AUC 為0.728，Cut-off 值為41.45，靈 敏度0.750 和特異度0.675，有一定的診斷效能。BALF 中性粒細(xì)胞比例聯(lián)合鏡下革蘭染色鑒別診斷肺炎和非肺炎患者的AUC 為0.731。聯(lián)合診斷效能稍高于單一BALF 中性粒細(xì)胞比例的診斷效能，BALF 中性粒細(xì)胞比例Cut-off 值為22.09，表明在得知革蘭染色結(jié)果的情況下，BALF 中性粒細(xì)胞比例高于22.09%，提示肺炎的可能性大，且其特異度明顯高于單一使用BALF 中興粒細(xì)胞比例鑒別診斷肺炎和非肺炎患者，對肺炎的診斷更具有準(zhǔn)確性。

本研究同時(shí)也具有一定的局限性，SONG 等［22］發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀可提高BALF 中細(xì)胞檢測的敏感性，我院BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)是依靠人工鏡檢來檢測，具有一定的誤差性，對結(jié)果有一定的影響。BALF 在采樣過程中灌洗的部位和灌洗液回收量、標(biāo)本的預(yù)處理都有可能影響到BALF 細(xì)胞分類計(jì)數(shù)［12，23］。在對肺炎患者的分析中并未對感染病原菌進(jìn)行分類分析，可進(jìn)一步對BALF 中性粒細(xì)胞比例在細(xì)菌和真菌性肺炎中的診斷效能進(jìn)行研究。并且，本研究為單中心回顧性研究，多中心前瞻性研究是有必要的。

綜上所述，BALF 中性粒細(xì)胞比例對肺炎具有較高的診斷效能，對重癥患者早期治療有提示意義。BALF 中性粒細(xì)胞比例聯(lián)合革蘭染色對肺炎患者有一定的早期診斷效能，對患者個(gè)體化治療和抗生素方案有一定指導(dǎo)作用，但需結(jié)合患者的臨床癥狀和影像結(jié)果等進(jìn)行多方位評(píng)估。