右美托咪定對宮頸癌細胞HSP90/ERK通路及順鉑敏感性的影響

楊利利 胡強夫 閔娜 王濤

1鄭州大學第五附屬醫(yī)院麻醉科（鄭州 450052）；2鄭州大學第三附屬醫(yī)院麻醉科（鄭州 450000）

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，雖然近年來其發(fā)病率、死亡率有所降低，但晚期患者5年生存率不足40%，仍是導致女性死亡的重要原因［1-2］。宮頸癌治療主要以手術輔助放化療為主，但對化療藥物的耐藥性往往影響化療療效，難以達到預期的臨床效果，導致預后結(jié)局差［3］。因此，尋找一種安全有效的途徑增強化療敏感性，對改善宮頸癌預后具有重要研究、應用價值。熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）可維護正常組織蛋白穩(wěn)定性，作為ATP 依賴性分子伴侶能參與腫瘤細胞生存、代謝過程，抑制其表達可逆轉(zhuǎn)腫瘤的順鉑耐藥性［4］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）活化后可調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞的異常增殖分化過程，在腫瘤進展、治療機制中均具有重要作用［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，觸發(fā)HSP90-ERK 途徑介導的食管鱗狀細胞癌DNA 修復可增強順鉑化學耐藥性［6］。右美托咪定是一類脂溶性的α2 腎上腺素激動劑，常用于臨床輔助手術麻醉，近年來在腫瘤根治術中廣泛應用。此外，右美托咪定能抑制宮頸癌細胞的存活與轉(zhuǎn)移［7］，減輕化療相關性惡心嘔吐［8］，且研究報道其能提高肺癌細胞A549 對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性［9］。為明確右美托咪定應用于宮頸癌的根治術、放化療等過程中是否有利于腫瘤治療，本研究從細胞層面上，探索右美托咪定對宮頸癌細胞HSP90/ERK 通路及順鉑敏感性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 常用試劑與儀器 人HeLa（HZ-CC100769），美國ATCC；順鉑（JKLN003484a）、右美托咪定（JKLN010388a），上海經(jīng)科；DMEM 培養(yǎng)基（KLP0032），德國merck/sigma；抗體：HSP90（ab13495）、ERK（ab184699）、p-ERK（ab201015）、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferases1，DNMT1）（ab19905）、DNA 聚合酶δ 催化亞基（DNA polymerase delta catalytic subunit gene 1，POLD1）（ab196561）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（ab18197）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ab104156）、GAPDH（ab181602），美國abcam；CCK-8（CK-04），日本同仁；AnnexinV-FITC/PI 試劑盒（S0185）購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS）、酶標儀（MODEL550），美國Bio-Rad；流式細胞儀（BD FACSCanto Ⅱ），美國BD。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 HeLa 細胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，融合80%左右時消化、傳代。

取對數(shù)期HeLa 細胞接種96 孔板（1 × 104個/孔），分為對照組（不做處理）、順鉑組（5 μg/mL 順鉑）、低濃度組（5 μg/mL 順鉑+3 μmol/L 右美托咪定）和高濃度組（5 μg/mL 順鉑+6 μmol/L 右美托咪定）。

1.2.2 Western blot 法檢測蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h 收集，提取總蛋白，定量。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后，分別于4 ℃加HSP90 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、DNMT1 抗體、POLD1 抗體、PCNA 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體（1∶500）過夜孵育，再室溫孵育羊抗兔二抗（1∶5 000）1 h，化學發(fā)光，拍攝圖像，分析蛋白灰度，以內(nèi)參GAPDH 為對照定量。

1.2.3 CCK-8 法檢測增殖 各組細胞培養(yǎng)48 h，加10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)2 h，酶標儀（450 nm）檢測吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h收集，消化、洗滌后調(diào)整為1 × 106個/mL，用5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI 避光孵育1 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以（）表示，采用Graph-Pad 軟件進行多組間比較（單因素方差分析）和進一步兩兩比較（SNK-q檢驗），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HeLa 細胞中HSP90/ERK 通路相關蛋白表達情況 與對照組相比，順鉑組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，低濃度組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1 and POLD1 protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s

表1 各組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1 and POLD1 protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s

注：較對照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值HSP90/GAPDH 0.90 ± 0.14 0.73 ± 0.11a 0.55 ± 0.07b 0.38 ± 0.05bc 30.977＜0.001 p-ERK/ERK 0.84 ± 0.09 0.62 ± 0.09a 0.50 ± 0.05b 0.37 ± 0.04bc 47.163＜0.001 DNMT1/GAPDH 0.93 ± 0.11 0.75 ± 0.09a 0.49 ± 0.05b 0.36 ± 0.05bc 62.500＜0.001 POLD1/GAPDH 0.88 ± 0.10 0.73 ± 0.11a 0.48 ± 0.07b 0.34 ± 0.04bc 49.532＜0.001

圖1 Western blot 檢測各組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達情況Fig.1 Western blot detect the HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1，and POLD1 protein expression in HeLa cells of each groups

2.2 各組HeLa 細胞增殖情況 順鉑組與對照組相比較，HeLa 細胞OD值降低（P＜0.05）；低濃度組與順鉑組相比較，HeLa 細胞OD 值顯著降低（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細胞OD 值顯著降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組HeLa 細胞凋亡情況 與對照組相比，順鉑組HeLa 細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，低濃度組HeLa 細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 各組HeLa 細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of HeLa cells in each groups

表2 各組HeLa 細胞OD 值比較Tab.2 Comparison of the OD values，apoptosis of HeLa Cells in each groups ±s

表2 各組HeLa 細胞OD 值比較Tab.2 Comparison of the OD values，apoptosis of HeLa Cells in each groups ±s

注：較對照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值OD 值0.53 ± 0.07 0.40 ± 0.07a 0.30 ± 0.04b 0.20 ± 0.03bc 38.813＜0.001凋亡率（%）6.42 ± 0.94 12.63 ± 1.13a 21.95 ± 1.26b 37.86 ± 2.04bc 567.597＜0.001

2.4 各組HeLa 細胞中增殖、凋亡蛋白表達情況順鉑組與對照組相比，PCNA 蛋白水平顯著降低，而Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；低濃度組與順鉑組相比，PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白顯著水平升高（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組HeLa 細胞中PCNA、Bax 蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of PCNA and Bax protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s，n = 6

表3 各組HeLa 細胞中PCNA、Bax 蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of PCNA and Bax protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s，n = 6

注：較對照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值PCNA/GAPDH 0.85 ± 0.10 0.57 ± 0.10a 0.40 ± 0.07b 0.26 ± 0.06bc 54.288＜0.001 Bax/GAPDH 0.25 ± 0.05 0.43 ± 0.05a 0.74 ± 0.07b 0.92 ± 0.08bc 133.742＜0.001

圖3 Western blot 檢測各組HeLa 細胞中PCNA、Bax 蛋白表達情況Fig.3 Western blot detect the PCNA，and Baxprotein expression in HeLa cells of each groups

3 討論

宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在女性相關死亡原因中居第四位?；熓浅Ｓ糜趯m頸癌的輔助治療方式，可影響細胞行為，有效減緩癌癥發(fā)展，減小手術切除后復發(fā)概率，延長患者生存時間［10］。目前，順鉑是臨床上常用于治療宮頸癌等癌癥的一線化療藥物，但其耐藥性的出現(xiàn)易降低宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，導致患者治療不理想［11］。手術切除作為臨床治療癌癥的核心治療方式，手術期的種種操作均可能是影響癌癥預后的重要因素，如手術造成的創(chuàng)口會影響機體免疫，給遺留癌細胞存活、轉(zhuǎn)移、增殖創(chuàng)造良好環(huán)境，影響患者預后，而有研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥的正確使用能減少手術期間癌細胞轉(zhuǎn)移風險，并促進癌細胞凋亡［12-13］。此外，由于癌細胞對化療藥物具有耐藥性或藥物本身敏感性不高，手術期間使用具有抗癌效果、能提高化療敏感性的麻醉藥，將有利于術后化療有效清除殘余癌細胞，提高患者預后。

右美托咪定是臨床常用的麻醉輔助用藥，具有鎮(zhèn)靜、止痛及保持血流動力學穩(wěn)定效應，常用于癌癥手術中［14］。此外，LIU 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，DEX 可降低TNF-α、IL-6 分泌量，抑制腫瘤炎癥微環(huán)境形成。王仕斌等［7］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能通過抑制PI3K/Akt 通路激活，進而抑制人宮頸癌Hela 細胞的增殖、侵襲、遷移行為，誘導Hela 細胞凋亡。CHI 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲亦具有抑制作用，其作用機制可能與抑制糖類抗原Tn 表達有關。然而，目前右美托咪定對宮頸癌順鉑敏感性的影響尚無研究，本研究采用順鉑、右美托咪定對人宮頸癌HeLa 細胞進行分組處理，以探究右美托咪定對宮頸癌的作用及可能作用機制，結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組HeLa 細胞OD 值及細胞增殖相關蛋白PCNA表達降低，細胞凋亡率與細胞凋亡家族成員促凋亡蛋白Bax 表達升高，驗證了順鉑的抑癌作用。進一步研究顯示，隨著右美托咪定的添加及濃度的升高，順鉑處理下的HeLa 細胞OD 值及PCNA 蛋白水平進一步降低，細胞凋亡率與Bax 蛋白水平進一步升高，表明右美托咪定可增強HeLa 細胞對順鉑的敏感性，從而抑制HeLa 細胞增殖并誘導其凋亡，且該作用隨濃度的升高而增強。

HSP90 是一組結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì)，是維持胞內(nèi)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定及功能正常所必需的分子伴侶，參與細胞穩(wěn)態(tài)與應激反應調(diào)節(jié)，在腫瘤治療中可降低腫瘤細胞對抗腫瘤藥的敏感性［17-18］。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的主要成員，介導生長、發(fā)育、分裂、死亡等多種細胞生理過程，在腫瘤細胞行為調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［19-20］。SUN 等［6］研究顯示，受體相互作用蛋白激酶3 通過HSP90/ERK 途徑調(diào)節(jié)DNA 修復，最終影響腫瘤的化學耐藥性。ZHOU等［21］研究表明，磷酸甘油酸激酶1 通過觸發(fā)HSP90/ERK 途徑介導的子宮內(nèi)膜癌的DNA 修復和甲基化來促進順鉑化學耐藥性。以上研究表明，HSP90/ERK 通路是化療發(fā)揮療效的重要靶點。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑組HeLa 細胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平顯著降低，表明順鉑可抑制HSP90/ERK 途徑激活，導致下游DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNA 修復相關蛋白POLD1 表達減少［22-25］，DNA 甲基化、DNA 修復水平降低，進而影響HeLa 細胞的增殖與凋亡過程。而使用右美托咪定處理后，HeLa 細胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平進一步降低，且高濃度右美托咪定對HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表達的抑制作用更明顯，表明右美托咪定可增強順鉑對HSP90/ERK 途徑的抑制作用，進一步降低DNA 甲基化、DNA 修復水平，增強HeLa 細胞的順鉑敏感性。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)右美托咪定能增強HeLa 細胞的順鉑敏感性，抑制HeLa 細胞增殖并誘導其凋亡，其過程可能與抑制宮頸癌HeLa 細胞中HSP90/ERK 通路，降低細胞內(nèi)DNA 甲基化、DNA 修復水平有關。但本研究僅在宮頸癌的一種細胞株中展開實驗得出該結(jié)論，且因不少研究認為HSP90/ERK 通路介導腫瘤細胞化療抵抗而未設置回復實驗，故將HSP90/ERK 通路作為右美托咪定影響HeLa 細胞順鉑敏感性的途徑不夠充分，后續(xù)研究會進行改進。