腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3相互作用蛋白1調(diào)控核因子κB信號通路在IDH野生型膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制

彭一鵬 周曉飛 王劍 藏春光 張悅盼 辛雪 朱春麗 付朋

武漢市紅十字會醫(yī)院1神經(jīng)外科，2神經(jīng)內(nèi)科（武漢 430015）；3華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科（武漢 430022）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性致命腫瘤［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的最新分類，神經(jīng)膠質(zhì)瘤可分為IDH 野生型和IDH 突變型［2］。與IDH 突變型膠質(zhì)瘤相比，IDH野生型膠質(zhì)瘤（IDH-wildtype glioblastoma，GBM）的臨床結(jié)局較差［3］。研究［4］表明，IDH 突變型和IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子特征、表觀遺傳特征和RNA 譜也不同。因此，有必要研究IDH 野生型膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的機(jī)制。腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白3 相互作用蛋白1（TNFα-induced prote in 3-interacting protein1，TNIP1）是一種細(xì)胞蛋白，它在癌癥、自身免疫和慢性炎癥中起著重要作用［5］。TNIP1誘導(dǎo)的核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）活性在免疫疾病和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［6］。據(jù)報(bào)道，TNIP1 的遺傳多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的風(fēng)險升高相關(guān)；高水平的TNIP1 與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)［7］。然而，TNIP1是否在IDH 野生型膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用仍有待闡明。本研究系統(tǒng)地分析了TNIP1 在中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集中膠質(zhì)瘤患者的表達(dá)及其預(yù)后價值，觀察到TNIP1 表達(dá)與IDH 野生型膠質(zhì)瘤的惡性程度之間的關(guān)系。然后進(jìn)一步探討了TNIP1 在IDH 野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型中的作用及相關(guān)機(jī)制，旨在確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理診斷和靶向治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和臨床信息從CGGA 官方網(wǎng)站（http：//www.cgga.org.cn/）和TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp）下載。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA；美國Scien Cell 公司）接種在星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Scien Cell 公司）中。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系H4、LN229 和U87 獲自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，并接種在含有10%胎牛血清（FBS；美國Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素（Gibco）的DMEM（Gibco）中。源自GBM 患者的細(xì)胞系N33 接種在含有10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12（Gibco）中。H4、LN229、U87 和N33 均為野生型細(xì)胞系［3］。

1.1.3 動物來源 5 周齡雌性BALB/c 無胸腺裸鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供［合格證編號：SCXK（京）2016-0006］，置于溫控室內(nèi)、12 h/12 h 的光/暗循環(huán)環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 將N33 細(xì)胞接種于6 孔板上，分為3 組：對照組、si-NC 組和si-TNIP1 組。48 h 后收集細(xì)胞和培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。si-NC 組和si-TNIP1 組分別將細(xì)胞轉(zhuǎn)染scramble siRNA（si-NC）、TNIP1 siRNA（si-TNIP1），對照組加入空白培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h 收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 GBM 細(xì)胞系中的基因調(diào)控 上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司生產(chǎn)了含有特定基因載體或特異性小干擾RNA（siRNA）序列的慢病毒：scramble siRNA（si-NC）、TNIP1 siRNA（si-TNIP1）和TNF 受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）siRNA（si-TRAF6）。使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）將這些基因的含有特定基因載體或特異性siRNA 轉(zhuǎn)染到GBM 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h 通過蛋白質(zhì)印跡測量轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 細(xì)胞增殖分析 將1.5 × 103個細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)6 d。在檢測時間點(diǎn)棄去上清液，加入含有10% Cell Counting Kit-8 溶液（CCK-8，日本Dojindo Laboratories 公司）的培養(yǎng)基，然后在37 ℃下孵育1 h。通過Varioskan Flash（美國Thermo Fisher Scientific 公司）測量每個孔中450 nm 處的吸光度。

1.2.4 Transwell 遷移試驗(yàn) 采用Transwell 室（美國Corning 公司）評估細(xì)胞遷移。將在無血清DMEM 中的GBM 細(xì)胞（1 × 105）添加到上室，下室加入含10% FBS 的DMEM。在37 ℃下孵育6 h 后，去除Transwell 膜上表面的細(xì)胞，將膜用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，并用0.01%結(jié)晶紫溶液（上海Beyotime 公司）染色，計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) N33細(xì)胞以3×105/孔接種于6 孔板，并在含有10% FBS 的DMEM/F12 中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，將細(xì)胞用200 μL 塑料移液管尖端劃傷并在不含F(xiàn)BS 的DMEM/F12 中培養(yǎng)48 h。使用顯微鏡評估細(xì)胞遷移率。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀（IP）分析 使用放射免疫沉淀測定緩沖液（美國CST 公司）提取總蛋白質(zhì)，并使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Merck Millipore 公司）。將膜在5% 脫脂牛奶中封閉1 h，與靶向GAPDH（1∶2 000，美國CST 公司），TNIP1（美國Abcam 公司，1∶2 000 稀釋）、TRAF6（Abcam，1∶2 000稀釋）和Phospho-NF-κB p65（pp65，CST，1∶500 稀釋）的一抗在4 ℃下孵育過夜，然后與HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶5 000，Abcam）在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光HRP 底物（美國Merck Millipore 公司）和帶有Image LabTM軟件的ChemiDocTMXRS+（美國Bio-Rad 公司）檢測免疫反應(yīng)條帶。

對于IP 測定，將U87 細(xì)胞接種在6 孔板中孵育48 h。然后收集細(xì)胞，并用抗Myc、抗Flag 或抗HA 抗體（均購自美國Abcam 公司）免疫沉淀細(xì)胞裂解物。IP 復(fù)合物通過SDS-PAGE（6% ～10%）電泳分離，并用抗Myc、抗Flag 或抗HA 抗體進(jìn)行免疫探測。對于泛素化測定，模擬載體、Flag-TRAF6和Myc-TNIP1 質(zhì)粒（均購自美國Addgene 公司）分別轉(zhuǎn)染到HA 標(biāo)記Ub 的U87 細(xì)胞中。細(xì)胞裂解物用抗-Myc 或抗-Flag 抗體免疫沉淀，并用抗-Myc、抗-Flag 或抗-HA 抗體探測。

1.2.7 RNA 提取和定量PCR（qPCR）分析 使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）分離總RNA，并使用nanodrop 2000 進(jìn)行定量?？偣? 000 ng RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBRTMSelect Master Mix（美國Thermo 公司）在7500 快速實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行實(shí)時定量分析。本研究中基因的引物序列見表1。

表1 基因的寡核苷酸引物序列Tab.1 Gene oligonucleotide primer sequences

1.2.8 原位異種移植模型 18只小鼠隨機(jī)分為3組，每組6 只，分別為：U87 NC 組，U87 oe-TNIP1 組和U87 si-TNIP1 組。在立體定向儀引導(dǎo)下，分別將空載體、oe-TNIP1 過表達(dá)或si-TNIP1 敲低載體轉(zhuǎn)染的U87 細(xì)胞（5 × 105）接種到三組裸鼠的右額葉結(jié)節(jié)中。接種位置是前囟門外側(cè)2 mm 和后2 mm。在第10、20 和30 天通過BLI 方法監(jiān)測腫瘤生長情況。小鼠腹膜內(nèi)注射d-熒光素（美國Promega 公司）并用體內(nèi)成像系統(tǒng)IVIS-Spectrum 小動物活體成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer 公司）測量腫瘤體積。在腫瘤細(xì)胞接種后35 d 處死裸鼠，然后收獲大腦并制備成福爾馬林固定石蠟包埋樣品，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在生存分析中，61 只小鼠分為3 組：U87 NC 組（n= 31），U87 oe-TNIP1 組（n= 21）和U87 si-TNIP1 組（n= 9）。按上述方法立體定向移植轉(zhuǎn)染的U87 細(xì)胞后，連續(xù)對小鼠進(jìn)行55 d 的生存考察，記錄各組小鼠的死亡情況。

1.2.9 免疫組織化學(xué)（IHC）分析 將組織切片脫蠟并在Tris 抗原修復(fù)緩沖液中煮沸。然后，將切片與針對Ki67（CST，1：200 稀釋），TNIP1（Abcam，1∶200 稀釋），TRAF6（Abcam，1∶200 稀釋）和NFκB p65（CST，1∶200 稀釋）的一抗一起孵育。使用顯微鏡捕獲免疫組織化學(xué)圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用R v3.4.1（https：//www.rproject.org/）、SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組均值比較使用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey 或Dunnett多重比較檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 方法用于比較不同組患者的總體生存時間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNIP1 表達(dá)與IDH 野生型膠質(zhì)瘤的關(guān)系 與GEPIA 網(wǎng)站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）中的非腫瘤腦組織相比，GBM 中TNIP1 的表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖1A）。在CGGA 數(shù)據(jù)集中，與非腫瘤腦組織相比，IDH 野生型GBM 病例中TNIP1 的表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖1B）。TNIP1 mRNA 表達(dá)隨著CGGA（圖1C）和TCGA（圖1D）數(shù)據(jù)集中IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級的增加而增加（P＜0.05）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（LN229 和U87 細(xì)胞）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者來源的N33 細(xì)胞中的TNIP1 蛋白表達(dá)水平均高于間變性星形細(xì)胞瘤H4 細(xì)胞（圖1E）。此外，在CGGA（圖1F）和TCGA（圖1G）數(shù)據(jù)集中，具有較高TNIP1 表達(dá)患者的OS 比具有低TNIP1 表達(dá)的患者差（P＜0.05）。然而，TNIP1 表達(dá)不能在CGGA 和TCGA 數(shù)據(jù)集中對IDH 突變神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存進(jìn)行分層（圖1H-K）。

2.2 TNIP1 表達(dá)的變化影響IDH-野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移 首先成功用特定的siRNA 敲低了N33 細(xì)胞中的TNIP1 表達(dá)（圖2A）。TNIP1 敲低顯著減弱了N33 細(xì)胞的遷移（P＜0.05，圖2B）、增殖（P＜0.05，圖2C）和抑制細(xì)胞的遷移率（P＜0.05，圖2D）。

圖2 TNIP1 可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型Fig.2 TNIP1 can promote the malignant phenotype of glioma cells

2.3 TNIP1 誘導(dǎo)TRAF6 蛋白的去泛素化以激活NF-κB Myc-TNIP1與Flag-TRAF6相互作用（圖3A，泳道4）。在不存在Myc-TNIP1 的情況下可以看到TRAF6 的泛素化（圖3B，泳道2），而在存在Myc-TNIP1 的情況下以劑量依賴性方式觀察到TRAF6的顯著去泛素化（圖3B，泳道3-5）。

在CGGA 和TCGA 數(shù)據(jù)集中，TNIP1 表達(dá)與TRAF6 表達(dá)顯著正相關(guān)（圖3C-D）。TNIP1 敲低還可以顯著調(diào)LN299 和N33 細(xì)胞中TRAF6 的表達(dá)（P＜0.05，圖3E-F）。

在U87 細(xì)胞中，觀察到磷酸化的NF-κB（pp65）隨著TRAF6 敲低而減少（圖3G）。此外，磷酸化的NF-κB（pp65）在TNIP1 敲低的U87 細(xì)胞中減少，但在TNIP1 過表達(dá)的U87 細(xì)胞中增加（圖3H）。

圖3 TNIP1 誘導(dǎo)TRAF6 蛋白的去泛素化以激活NF-κBFig.3 TNIP1 induces deubiquitination of TRAF6 protein to activate NF-κB

2.4 TNIP1促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長、存活率低和NF-κB激活 與空載體的異種移植物相比，oe-TNIP1 的異種移植物顯示出加速的腫瘤進(jìn)展，而si-TNIP1 的異種移植物顯示出減慢的腫瘤進(jìn)展（圖4A、B）。oe-TNIP1 異種移植物的小鼠的存活結(jié)果較差，而si-TNIP1 的異種移植物小鼠則表現(xiàn)出更長的生存期（P＜0.05，圖4C）。此外，Ki-67 陽性細(xì)胞以及TNIP1、TRAF6、NF-κB（p65）水平在oe-TNIP1 的異種移植物中增加，而在si-TNIP1 的異種移植物中減少（圖4D）。

圖4 TNIP1 在原位異種移植模型中促進(jìn)腫瘤生長并導(dǎo)致更差的預(yù)后Fig.4 TNIP1 promotes tumor growth and leads to worse prognosis in an orthotopic xenograft model

3 討論

研究［8-9］表明，TNIP1 通過多種機(jī)制在維持癌細(xì)胞的治療抗性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，TNIP1 在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中的作用在很大程度上仍然難以捉摸。本研究中，TNIP1 表達(dá)隨著IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增加，而不是IDH 突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤。較高的TNIP1 表達(dá)也與IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者較差的存活率相關(guān)。此外，本研究證明TNIP1 可以在IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明TNIP1 可能在IDH 突變型和IDH 野生型膠質(zhì)瘤中發(fā)揮不同的作用，并且TNIP1 可以促進(jìn)IDH 野生型膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。

近幾年研究［10-12］表明，泛素化和去泛素化通過調(diào)節(jié)癌癥代謝在癌癥發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CAI 等［13］報(bào)道，TNIP1 需要泛素結(jié)合來限制細(xì)胞凋亡。因此，TNIP1 的去泛素化與泛素化蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能密切相關(guān)［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)TNIP1 誘導(dǎo)TRAF6 蛋白的去泛素化以激活NF-κB，并隨后在體外和體內(nèi)促進(jìn)IDH 野生型膠質(zhì)瘤進(jìn)展。相關(guān)研究顯示，TRAF6 能同時誘導(dǎo)TAK1 結(jié)合蛋白2 和TGF-β 激活激酶1 的K63 連接泛素化以激活NFκB，從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展［16］。據(jù)報(bào)道，TRAF6 表達(dá)在預(yù)后較差的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中增加，升高的TRAF6 促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移［7］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)TNIP1 表達(dá)與TRAF6 表達(dá)顯著正相關(guān)，并且TNIP1 可以通過調(diào)節(jié)TRAF6 來調(diào)節(jié)NF-κB。這些結(jié)果表明，TNIP1 通過調(diào)節(jié)TRAF6 蛋白的去泛素化來促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

NF-κB 是參與促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的核心因子［17-18］。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的間充質(zhì)分化過程中，NF-κB可以被內(nèi)在和外在信號激活［19］。激活的NF-κB 上調(diào)CD44、波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)，并介導(dǎo)STAT3、CEBPB 和TAZ 的激活［20］。此外，NF-κB 可以通過改變分泌細(xì)胞因子的類型和ECM 蛋白和酶的表達(dá)來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲、血管生成和治療抵抗［21］。研究［22］表明在用替莫唑胺治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤期間，TRAF6 的上調(diào)需要激活NF-κB。本研究證明了抑制TRAF6可以抑制NF-κB活化。據(jù)報(bào)道NF-κB 和TRAF6 都與神經(jīng)膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的抗性有關(guān)［23-25］，推測NF-κB 和TRAF6 之間存在的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與TNIP1 上行調(diào)制有關(guān)。然而，詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制仍有待在未來的研究中闡明。

總之，本研究結(jié)果表明TNIP1 表達(dá)隨著IDH 野生型神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增加。TNIP1還可以在體外和體內(nèi)模型中促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。從機(jī)制上講，TNIP1 可以誘導(dǎo)TRAF6 蛋白的去泛素化以激活NF-κB。這些發(fā)現(xiàn)將有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的病理診斷和TNIP1 靶向治療。然而，NF-κB 和TRAF6 之間存在的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與TNIP1 調(diào)制之間的關(guān)聯(lián)仍有待進(jìn)一步研究。