寧波地區(qū)耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌的分子生物學(xué)特征研究

高 暉，屠艷燁，吳巧萍，李情操，楊 燁，裘雪丹

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是一種革蘭陰性兼性厭氧菌，常引起多種機(jī)會(huì)性感染疾病，如肺炎、腦膜炎、肝膿腫等[1-2]。與經(jīng)典肺炎克雷伯菌不同，高毒力肺炎克雷伯菌可在健康或免疫功能低下的個(gè)體中引起侵襲性感染，往往預(yù)后較差、致死率較高[3]。以往研究認(rèn)為高毒力肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素高度敏感，然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae,CR-hvKP)的存在。兼具耐藥性和高毒力的CR-hvKP通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重院內(nèi)感染，尤其是院內(nèi)小規(guī)模的流行暴發(fā)給臨床的抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[4]。此外，CR-hvKP分子流行特征具有多樣性，因此本課題組收集寧波地區(qū)3家醫(yī)院150株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌，通過(guò)對(duì)寧波地區(qū)CR-hvKP耐藥基因及毒力基因的分析研究，為本地區(qū)CR-hvKP的院感防控及臨床抗感染治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集自寧波市3家醫(yī)院臨床分離的150株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(CRKP)。入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S31標(biāo)準(zhǔn)判讀，亞胺培南MIC法≥16 μg/mL為耐藥[5]；耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)的判定標(biāo)準(zhǔn)：①亞胺培南MIC≥16 μg/mL；②拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；③毒力基因rmpA陽(yáng)性。須同時(shí)滿(mǎn)足以上3個(gè)條件，用WHONET 5.6軟件剔除重復(fù)分離菌株。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥物敏感分析 采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定和體外藥敏試驗(yàn)，用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer法)進(jìn)行藥敏驗(yàn)證，亞胺培南藥敏紙片購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，根據(jù)CLSI指南KB法亞胺培南≤13 mm為耐藥；質(zhì)控菌株大腸埃希菌(ATCC25922)和陰溝腸桿菌(ATCC700323)由寧波市臨床檢驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.3 高黏液表型的篩選 將150株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌接種于哥倫比亞血平板中，二氧化碳培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日用接種環(huán)挑起單一菌落，若兩次挑起形成的黏液絲長(zhǎng)度≥5 mm，則為拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

1.4 細(xì)菌DNA提取 從哥倫比亞血瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落置于含250 μL滅菌蒸餾水的滅菌EP管中，震蕩混勻后100 ℃高溫金屬浴加熱煮沸10 min，經(jīng)12 000 r/min高速離心5 min后，吸取上清至1.5 mL滅菌EP管中，保存在-20 ℃冰箱備用。

1.5 菌株血清莢膜型及毒力基因檢測(cè) 利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)CR-hvKP的6種常見(jiàn)莢膜多糖基因K1、K2、K5、K20、K54、K57；常見(jiàn)毒力基因包括莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因(rmpA、magA)、鐵載體基因(aerobactin、kfu、entB)、菌毛定值與黏附基因(ureA、fimH、kpn、allS、mrkD)、脂多糖形成相關(guān)基因(uge、wabG)，擴(kuò)增引物序列參照文獻(xiàn)[6-8]，部分引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)；整合子intI1型引物序列為F：CCAAGCTCTCGGGTAACATC；R：CCCGAGGCATAGACTGTA；intI2、intI3型引物參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，Tag酶10 μL，加ddH2O至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 CR-hvKP常見(jiàn)毒力基因引物Tab.1 CR-hvKP common virulence gene primers

1.6 碳青霉烯類(lèi)耐藥基因檢測(cè) 利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯類(lèi)相關(guān)耐藥基因，耐藥基因包括A類(lèi)的碳青霉烯酶(KPC)；B類(lèi)的亞胺培南酶(IMP)、新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)、維羅納整合子編碼金屬β-內(nèi)酰胺酶(VIM)；D類(lèi)的苯唑西林酶48(OXA-48)，引物序列參照文獻(xiàn)[10]。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Tag酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳 電壓110 V，電泳時(shí)間15 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀拍攝電泳圖，并將目的條帶送去上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 WHONET 5.6 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以菌株數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 CR-hvKP標(biāo)本來(lái)源、臨床科室分布及對(duì)抗菌藥物的耐藥率 150株CRKP標(biāo)本類(lèi)型來(lái)源分別為痰液(78株，52.0%)、全血(26株，17.3%)、尿液(23株，15.3%)、分泌物(13株，8.7%)、引流液(4株，2.7%)、糞便(2株，1.3%)、膽汁(2株，1.3%)及其他類(lèi)型(2株，1.3%)；150株CRKP病區(qū)分布情況，其中ICU檢出CRKP最多(68株，45.3%)，其次為呼吸內(nèi)科(29 株，19.3%)、血液科(14 株，9.3%)、泌尿外科(13株，8.6%)、感染科(11株，7.3%)、心血管內(nèi)科(8株，5.3%)、神經(jīng)外科(5株，3.3%)以及其他科室(2株，1.3%)。

通過(guò)拉絲實(shí)驗(yàn)及rmpA基因檢測(cè)，從150株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌中篩選出14株CR-hvKP，檢出率為9.33%(14/150)。主要分離自全血6株、痰液5株、尿液1株、糞便1株和分泌物1株；其中5株CR-hvKP來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房ICU，其次為呼吸內(nèi)科3株、血液科3株，泌尿外科、感染科和心胸外科各1株(表2)，14株CR-hvKP除對(duì)阿米卡星和復(fù)方新諾明的耐藥率為57.14%以外，對(duì)表中其它抗生素的耐藥率均在85%以上(表3)。

表2 14株CR-hvKP基本資料Tab.2 Basic information on the 14 CR-hvKP strains

表3 14株CR-hvKP對(duì)抗菌藥物的耐藥情況Tab.3 Resistance rates of the 14 CR-hvKP strains to antibiotics

2.2 CR-hvKP表型及耐藥基因檢測(cè) 14株CR-hvKP拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，莢膜血清分型結(jié)果顯示9株為K2型，1株為K57型，4株未分型；14株均為intI1型整合子，intI2型、intI3型整合子均未檢出。檢測(cè)14株CR-hvKP耐藥基因結(jié)果顯示，12株(85.71%)攜帶KPC-2基因，4株(28.57%)攜帶NDM-1基因，1株(7.14%)攜帶IMP-1基因，其中有3株(21.43%)同時(shí)攜帶KPC-2和NDM-1基因(表4)。

表4 14株CR-hvKP莢膜血清型、耐藥基因及整合子檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection of the capsular serotype,drug resistance genes and integron type in 14 CR-hvKP strains

2.3 CR-hvKP毒力基因檢測(cè) 對(duì)14株CR-hvKP的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示14株CR-hvKP均攜帶rmpA、kpn、entB、wabG、ureA、fimH基因，攜帶率為100%；13株攜帶uge基因，攜帶率為92.86%；6株攜帶mrkD基因，攜帶率為42.86%；2株攜帶aerobactin基因，攜帶率為14.29%；攜帶kfu、allS基因各1株，攜帶率僅為7.14%；未發(fā)現(xiàn)攜帶magA基因菌株;且14株菌株攜帶的毒力基因最多達(dá)9種。見(jiàn)圖1和表5。

圖1 毒力因子在CR-hvKP中所占比例Fig.1 Proportion of virulence factors in CR-hvKP

表5 14株CR-hvKP毒力基因攜帶情況Tab.5 Virulence gene carriage status of 14 CR-hvKP strains

3 討 論

近年來(lái)，隨著高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKP)耐藥性的增強(qiáng)，越來(lái)越多的臨床CR-hvKP分離株被報(bào)道[11]。CR-hvKP在健康人群中常常會(huì)引起嚴(yán)重的、難以治療的感染疾病，Zhou等發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)CR-hvKP的臨床檢出率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，已對(duì)公共健康構(gòu)成重大威脅[12]。本研究從寧波地區(qū)3家醫(yī)院150株耐碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌中篩查出14株CR-hvKP(9.33%)，檢出率明顯高于Zhang等人報(bào)道的國(guó)內(nèi)平均水平(5.2%)[13]。14株CR-hvKP主要分離自全血(6株，42.9%)和痰液(5株，35.7%)，與王晶俏等報(bào)道的徐州地區(qū)CR-hvKP主要分離自痰液有所不同[14]，本地區(qū)血流感染的CR-hvKP占據(jù)主要地位，提示傳播情況較為嚴(yán)重；本地區(qū)患者主要來(lái)自ICU(5株，35.7%)、呼吸科(3株，21.4%)和血液科(3株，21.4%)，可能與上述科室抗生素的長(zhǎng)期高劑量應(yīng)用及血液病人本身免疫功能低下有關(guān)。

本研究對(duì)14株CR-hvKP的莢膜血清型分型結(jié)果顯示，9株為K2型，1株為K57型，4株未分型為非常見(jiàn)莢膜血清型，這與主流報(bào)道的CR-hvKP常見(jiàn)莢膜血清型為K1、K2型相一致[13]，而與Zhou等報(bào)道上海地區(qū)分離的CR-hvKP莢膜血清型主要為K64型明顯不同[12]，且本次篩選本地區(qū)CR-hvKP未發(fā)現(xiàn)K1型莢膜，這與CR-hvKP形成的基因多態(tài)性有關(guān)，因此莢膜血清型存在地域差異。14株CR-hvKP的藥敏結(jié)果顯示其對(duì)臨床常用抗生素呈現(xiàn)多重耐藥性，對(duì)14株CR-hvKP耐藥基因檢測(cè)顯示，寧波地區(qū)耐碳青霉烯類(lèi)耐藥基因以KPC-2基因?yàn)橹?12株，85.71%)，這與Zhang等2020年全國(guó)多中心CR-hvKP的研究結(jié)果相符合[13]，但攜帶NDM-1基因(4株，28.57%)和IMP-1基因(1株，7.14%)的CR-hvKP檢出率比上海地區(qū)要明顯升高[12]，此外，我們首次在寧波地區(qū)檢出了同時(shí)攜帶KPC-2和NDM-1基因(3株，21.43%)的CR-hvKP，可能與其同時(shí)攜帶多種耐藥質(zhì)粒有關(guān)，其具體耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。經(jīng)檢測(cè)14株CR-hvKP均為intI1型整合子，未檢出intI2型、intI3型整合子，與以往文獻(xiàn)報(bào)道肺炎克雷伯菌攜帶I類(lèi)整合子相一致[15]。

CR-hvKP的毒力因子在其致病機(jī)制中具有重要作用，本研究對(duì)14株CR-hvKP的毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與莢膜多糖生成有關(guān)的基因(rmpA、wabG、kpn)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因(aerobactin、kfu、entB、ureA、uge)、菌毛介導(dǎo)的與宿主細(xì)胞黏附相關(guān)的基因(allS、fimH、mrkD)均有不同程度的表達(dá)，其中kpn、entB、wabG、ureA、fimH攜帶率最高，為100%；其次為mrkD基因，攜帶率為42.86%；氣桿菌素鐵載體aerobactin基因攜帶率為14.29%；而kfu、allS基因攜帶率僅為7.14%；本地區(qū)未發(fā)現(xiàn)攜帶magA基因的菌株；且KP1和KP11號(hào)菌株攜帶多達(dá)9種毒力基因。對(duì)于14株CR-hvKP的具體形成機(jī)制，需要進(jìn)一步研究進(jìn)行闡明。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，非高毒力耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌可通過(guò)pLVPK-like毒力質(zhì)粒獲得hvKP攜帶的毒力基因[16]，hvKP也可以經(jīng)碳青霉烯類(lèi)抗生素誘導(dǎo)外膜孔蛋白變異或捕獲編碼碳青霉烯酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)變?yōu)镃R-hvKP[17-19]，后續(xù)我們將對(duì)2株攜帶氣桿菌素鐵載體aerobactin基因的菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)其形成的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

目前，臨床感染CR-hvKP呈逐漸上升趨勢(shì)，而對(duì)于CR-hvKP的形成機(jī)制及致病機(jī)理卻并未完全闡明，Gu等報(bào)道了一起院內(nèi)CR-hvKP暴發(fā)事件[20]，為我們敲響了CR-hvKP院內(nèi)感染的警鐘。因此，了解本地區(qū)CR-hvKP的分子流行特征及耐藥分布，加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)及管控臨床抗生素的使用，對(duì)減少CR-hvKP的院內(nèi)感染及傳播具有重要意義。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：高暉，屠艷燁，吳巧萍，等.寧波地區(qū)耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌的分子生物學(xué)特征研究[J]．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(9)：796-801.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.115