細粒棘球絳蟲體外不同發(fā)育時期EgM9基因差異表達研究

陳云英，王冰潔，潘星羽，余婉容，吾力江·卡馬力，趙 莉，班萬里，劉 帥，郭 璐，段蘭利，徐 晶，穆尼拉·特列吾汗，喻昌盛，烏云花，張壯志

細粒棘球蚴病俗稱囊型包蟲病(Cystic echinococcosis，CE)，是由細粒棘球絳蟲(Echinococcosisgranulosus，Eg)中絳期幼蟲引起的一種人獸共患寄生蟲病[1-2]。Eg在犬的小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲，45 d后發(fā)育為帶有孕節(jié)的成蟲釋放蟲卵，蟲卵隨糞便排出體外，污染外界環(huán)境[3]。在中亞地區(qū)，至少有2.7億人處于囊型棘球蚴病的高危環(huán)境中[4]。2012—2016年的一項全國調(diào)查顯示，中國西部地區(qū)約有5 000萬人有感染該病的風險，其中約有17萬人是棘球蚴病患者[5]。我國是包蟲病發(fā)病率最高的國家之一，病例多發(fā)于新疆、寧夏、西藏等以畜牧業(yè)為主要經(jīng)濟來源的地區(qū)[6]，該病主要寄生于肝肺，危害主要以機械性損害為主，嚴重程度取決于感染棘球蚴的體積、數(shù)量、寄生時間等[7]。

包蟲病在我國高發(fā)流行，但目前缺乏有效的技術手段控制該病。犬作為傳播的核心傳染源，缺乏有效的疫苗接種，關鍵原因在于缺乏明確功能的疫苗靶基因。通過差異顯示和基因組學研究不同發(fā)育階段的蟲體，發(fā)現(xiàn)EgM9基因是細粒棘球絳蟲成蟲階段的特異基因，尤其在其體表和睪丸中高表達[9]。用原核表達抗原接種犬可明顯減少蟲體數(shù)量和抑制蟲體發(fā)育，提示EgM9可能是蟲體發(fā)育尤其是睪丸發(fā)育的關鍵基因，影響精子的產(chǎn)生。目前在GenBank中還沒有發(fā)現(xiàn)與編碼EgM9蛋白的相似序列，對于EgM9蛋白的功能以及成熟蟲體蟲卵的基因表達的研究也不是十分清楚[10]。EG-09888基因在細粒棘球絳蟲成蟲減數(shù)分裂受精卵的形成過程中高表達[11-12]，所以本試驗通過建立細粒棘球絳蟲原頭蚴(protoscoleces,PSCs)向成蟲方向發(fā)育體外培養(yǎng)模型，用熒光定量PCR方法確定不同發(fā)育時期EgM9及EG-09888的表達情況，為探索EgM9基因在細粒棘球絳蟲成蟲發(fā)育中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 倫理申明 本研究獲得了新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所倫理委員會的批準(批準號：2021-03)，所有動物均按照中華人民共和國動物倫理程序和指南進行處理。

1.2 蟲株 細粒棘球絳蟲原頭蚴(PSCs)采自于新疆烏魯木齊市華凌市場新鮮屠宰的自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟，細粒棘球絳蟲(Eg)由本實驗室分離保存。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone公司)；胎牛血清(BI)；酵母、葡萄糖、牛磺膽酸鹽、胰蛋白酶、胃蛋白酶、1%亞甲基藍(Sigma公司)；蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SG Fast qPCR Mix(上海生工生物技術有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 原頭蚴的采集 將自然感染帶有包囊的綿羊肝臟帶回實驗室，用蒸餾水沖洗肝臟表面，用75%酒精進行表面消毒，在超凈臺中切開包囊，吸出囊液，從中分離出細粒棘球絳蟲原頭蚴，用含雙抗的PBS清洗5遍。

1.4.2 原頭蚴的活力檢測 按照1∶10的比例加入1%的胃蛋白酶溶液(pH2.0)，37 ℃水浴消化30 min后，用含雙抗的PBS清洗3遍，1 μL原頭蚴加入1%亞甲基藍9 μL染色3 min檢測活力。活性好的原頭蚴呈無色，活性差的呈藍色，重復3次取平均值，活力達到99%以上的原頭蚴可用于體外培養(yǎng)試驗。若活力在95%以下，建議增加漂洗次數(shù)除去活力不佳的原頭蚴后重新檢測[13-14]。

1.4.3 體外培養(yǎng)模型的建立 將5 000枚原頭蚴加入細胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(61 mLRPMI-1640，20 mL胎牛血清，10 mL 2%胰蛋白酶，4.5 mL 5%酵母，1.5 mL 3%葡萄糖，1 mL青鏈霉素，1 mL 0.2%?；悄懰徕c，1 mL HEPS)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2 d換液觀察有無污染情況，棄掉原培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3 d換1次液，每天鏡下觀察蟲體狀態(tài)。

1.4.4 不同發(fā)育時期蟲體收集 培養(yǎng)第0 d、第1 d、第5 d、第20 d、第30 d、第40 d、第50 d的蟲體在顯微鏡下觀察拍照并收集樣本，分別保存于4 ℃、4%多聚甲醛中和-80 ℃、RNA later中，用于后續(xù)的H&E染色、RNA提取及熒光定量PCR檢測。

1.4.5 不同發(fā)育時期蟲體H&E染色 將保存于4%多聚甲醛中的蟲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，用稀釋10倍的蘇木素染液染色過夜，用30%～70%酒精逐級脫水，1%鹽酸-酒精褪色10 s，透明15～30 min，中性樹膠封片。

1.4.6 引物設計和合成 參照GenBank上已公布的β-Actin(XM_024499161)、EgM9(AF482720)、EG-09888(XM_024499137)mRNA基因序列使用Primer Premier 5.0分別設計引物，送北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。β-Actin的引物序列為F：5′-GGTTACATCCCTCCGACCTTG-3′，R：5′-AA-GCAGCCTCCTCTTGAGTG-3′，Tm=60 ℃，片段大小為243 bp；EgM9的引物序列為F：5′-GTGAATTTTGCCTGCCCGTT-3′，R：5′-GCACA-ACCTCAGTCATGGGT-3′，Tm=65 ℃，片段大小為142 bp；EG-09888的引物序列為F：5′-AATCAGGGTCCCAACGTCAT-3′，R：5′-ATCGCA-ACGTGAAGAACTCG-3，Tm=65 ℃，片段大小為183 bp。

1.4.7 RNA提取、cDNA合成 取蟲體10 μL(約2 000條)按RNA提取試劑盒操作步驟提取蟲體RNA，并用Mighty Script第一鏈cDNA合成Master Mix(去基因組DNA)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.8 熒光定量PCR反應 熒光定量PCR反應體系20 μL：2×SG Fast qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL，用ddH2O補至20 μL。反應程序：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性3 s，65 ℃ 退火/延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣本3個重復，程序結(jié)束后自動得出熔解曲線。

2 結(jié) 果

2.1 細粒棘球絳蟲原頭蚴向成蟲方向體外發(fā)育模型的建立 細粒棘球絳蟲原頭蚴向成蟲方向體外發(fā)育模型見圖1。獲得的Eg原頭蚴活力近99%，Eg原頭蚴呈現(xiàn)兩種形態(tài)：一種為頂突凹入，一種為頂突外翻(圖1A)。培養(yǎng)第1 d時原頭蚴活力較好，少部分原頭蚴出現(xiàn)外翻(圖1B)；培養(yǎng)第5 d時原頭蚴出現(xiàn)明顯伸縮蠕動，有部分原頭蚴頭節(jié)外翻，頂突和4個吸盤完全翻出(圖1C)；第15～21 d時大量原頭蚴開始外翻且體節(jié)有增長趨勢，頸部以下狹窄和清晰的區(qū)域標志著第1節(jié)片已形成生殖器官雛形(圖1D)；在第21 d時，出現(xiàn)了明顯的分節(jié)現(xiàn)象，產(chǎn)生幼節(jié)(圖1E)；第30～40 d分節(jié)現(xiàn)象逐漸明顯，幼節(jié)長度逐漸增長(圖1F-G)；第50 d產(chǎn)生成節(jié)，此時蟲體形態(tài)為3個節(jié)片(圖1H)。

A：PSCs活力鑒定(1%亞甲基藍染色成活率為99%)；B：體外培養(yǎng)第1 d的PSCs；C：體外培養(yǎng)第5 d的PSCs；D：體外培養(yǎng)第10 d的PSCs；E：體外培養(yǎng)第20 d的PSCs；F：體外培養(yǎng)第30 d的PSCs；G：體外培養(yǎng)第40 d的PSCs；H：體外培養(yǎng)第50 d的PSCs。圖1 顯微鏡下體外發(fā)育不同時期蟲體形態(tài)變化(10×)Fig.1 Morphological changes of PSCs in different developmental stages in vitro(10×)

2.2 蟲體H&E染色結(jié)果 體外培養(yǎng)不同時期的蟲體經(jīng)H&E染色(圖2)，第0 d原頭蚴呈圓形，內(nèi)部可見內(nèi)陷的頂突小鉤(圖2A)；體外培養(yǎng)至10 d時，頂突開始外翻，朝鏈體節(jié)方向發(fā)育，有少量鈣質(zhì)小體(圖2B)；第20 d時出現(xiàn)分節(jié)現(xiàn)象產(chǎn)生幼節(jié)(圖2C)；第21～40 d時隨著時間的推移幼節(jié)長度也在增長，鏈體節(jié)的節(jié)片由此向后連續(xù)長出(圖2D-E)；在50 d時產(chǎn)生成節(jié)(圖2F)。

A：體外培養(yǎng)第0 d的PSCs；B：體外培養(yǎng)第10 d的PSCs；C：體外培養(yǎng)第20 d 的PSCs；D：體外培養(yǎng)第30 d的PSCs；E：體外培養(yǎng)第40 d的PSCs；F：體外培養(yǎng)第50 d的PSCs。圖2 體外發(fā)育不同時期蟲體H&E染色(10×)Fig.2 H&E staining of PSCs at different stages of development in vitro(10×)

2.3 引物特異性 內(nèi)參基因和目的基因的熔解曲線見圖3。從熔解曲線可看出，β-Actin、EgM9、EG-09888基因的熔解溫度均為65 ℃，基線平穩(wěn)，呈單峰，無非特異性擴增產(chǎn)物和二聚體，表明引物具有極好的特異性。

A：β-Actin基因熔解曲線；B：EgM9基因熔解曲線；C：EG-09888基因熔解曲線。圖3 內(nèi)參基因和目的基因的熔解曲線Fig.3 Melting curves of reference and target genes

2.4EgM9基因在細粒棘球絳蟲體外發(fā)育不同時期的表達分析 從圖4中可以看出，EgM9基因隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加其表達量也在升高，第20 d表達量與第0 d比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.31，P<0.05)；第20、30、40 d表達量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.072，P>0.05)；第50 d表達量最高，與之前不同培養(yǎng)天數(shù)蟲體的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=11.32，P<0.05)。EgM9和EG-09888基因在各時期的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

①：P<0.05；②：P>0.05圖4 蟲體不同發(fā)育階段EgM9和EG-09888基因的表達情況Fig.4 PSCs expression of the EgM9 gene and EG-09888 gene in different developmental stages

3 討 論

體外培養(yǎng)寄生蟲是在無菌、適當?shù)臏囟?、濕度和必需營養(yǎng)物質(zhì)條件下體外完成整個生長發(fā)育過程并維持其結(jié)構和功能，具有可以簡化其生長環(huán)境、方便添加試驗因素、容易觀測試驗結(jié)果的優(yōu)點。由于體內(nèi)培養(yǎng)試驗存在一定不便，如棘球蚴的生長發(fā)育不能清晰直觀地觀察和研究。因此，對細粒棘球絳蟲原頭蚴的體外培養(yǎng)，很多學者進行了不同的嘗試[15-18]。本試驗采用“無干擾、非宿主的”厭氧培養(yǎng)體系，該體系不存在外來生物組織、細胞及細胞因子等，通過加入適量膽酸鹽和胰蛋白酶為原頭蚴提供最佳培養(yǎng)條件，原頭蚴可以在完全沒有宿主細胞的情況下保持活性并發(fā)育。

在我們的研究中原頭蚴體外培養(yǎng)第3～5 d外翻率為70%～80%。培養(yǎng)第17～21 d外翻率為60%～70%，并觀察到第1節(jié)片的產(chǎn)生；培養(yǎng)第25～30 d和第37～40 d，表現(xiàn)為幼節(jié)的增長；培養(yǎng)第50 d，成節(jié)出現(xiàn)。但在培養(yǎng)50 d后，蟲體不能進一步發(fā)育并出現(xiàn)了崩解現(xiàn)象，不再發(fā)現(xiàn)其他生殖器官的明顯發(fā)育。由于寄生蟲生活史較復雜，加之對營養(yǎng)要求高，因此體外培養(yǎng)比較困難，終末宿主犬腸道系統(tǒng)的多樣化環(huán)境，不僅包括腸道內(nèi)容物，還包括潛在的宿主分泌因子都對其體內(nèi)成蟲發(fā)育具有相關作用，但體外培養(yǎng)未能提供其生殖發(fā)育相關因子，可能是導致其生殖器官不明顯的主要因素。體外培養(yǎng)原頭蚴的生長發(fā)育與培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性、pH值、溫度以及原頭蚴的密度等有很大關系[15,19-20]。根據(jù)Mohammadzadeh等[21]研究顯示體外培養(yǎng)的原頭蚴向成蟲方向發(fā)育總是落后于犬體內(nèi)的發(fā)育，表示體外培養(yǎng)蟲體具有一定滯后性，且均未發(fā)現(xiàn)生殖器官的全面發(fā)育。

張文寶等[9-10]篩選出了成熟蟲體的特異性表達基因，即EgM9基因家族，進行免疫實驗，結(jié)果顯示EgM9蛋白免疫效果最好，可以使蟲體發(fā)育受阻，減卵率達到97.7%，蟲體數(shù)量明顯減少。趙莉等[22]監(jiān)測重組蛋白EgM9免疫犬的特異性抗體變化，證實EgM9與Iscom佐劑結(jié)合能引起犬特異性免疫應答。郭寶平等[23]也對EgM9抗原的免疫保護作用進行了實驗，結(jié)果證實了EgM9蛋白對犬有很好的免疫保護效果。EgM9基因可能是蟲體發(fā)育尤其是睪丸發(fā)育的關鍵基因，影響精子的產(chǎn)生。因此，本試驗以β-Actin基因為內(nèi)參，對蟲體不同發(fā)育階段EgM9和EG-09888基因的表達情況進行研究，采用熒光定量PCR的相對定量，通過2-ΔΔCt法可以將定量結(jié)果校正為以細胞或基因組為單位，從而使不同樣品之間具有可比性，可用于比較mRNA的表達情況[24-25]。雖然通過形態(tài)學鑒定未觀察到培養(yǎng)的蟲體體內(nèi)有明顯的雄性器官如睪丸的產(chǎn)生及雌性器官子宮的產(chǎn)生，但通過熒光定量PCR檢測EgM9和EG-09888基因在各時期表達量差異無統(tǒng)計學意義。由于EG-09888基因調(diào)控細粒棘球絳蟲減數(shù)分裂中精子的發(fā)生，在細粒棘球絳蟲成蟲階段高表達，預示蟲體有雄性器官發(fā)育形成的趨勢，也證實EgM9與EG-09888基因在細粒棘球絳蟲成蟲中共同管控精子的產(chǎn)生和發(fā)育。但由于體外培養(yǎng)蟲體發(fā)育的滯后性，因此未能觀察到生殖器官的明顯特征。體外培養(yǎng)的蟲體第3節(jié)片產(chǎn)生時，其EgM9基因表達量就開始增高，可能是由于蟲體進行減數(shù)分裂，向成蟲階段發(fā)育。

綜上所述，通過體外培養(yǎng)，可以獲得不同發(fā)育時期的細粒棘球絳蟲，為研究基因表達以及基因干預提供材料，同時明確EgM9基因在成蟲發(fā)育及蟲卵產(chǎn)生中的功能，可為其作為犬用疫苗靶抗原奠定理論基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：陳云英，王冰潔，潘星羽，等.細粒棘球絳蟲體外不同發(fā)育時期EgM9基因差異表達研究[J]．中國人獸共患病學報，2022，38(9)：784-789.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.119