引起皮膚軟組織感染的殺白細(xì)胞素陽(yáng)性社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子特征研究

應(yīng)曉波，張傳領(lǐng)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起皮膚和軟組織感染(skin and soft tissue infections，SSTIs)最常見(jiàn)的病原體，可引起膿皰病、壞死性筋膜炎等疾病[1]。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生多種毒力因子，其中殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)是一種雙組分孔隙形成毒力蛋白，與皮膚軟組織感染密切相關(guān)[2]。社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(community-associated methicillin-resistantStaphylococcusaureus，CA-MRSA)是常見(jiàn)的耐藥性社區(qū)群體感染病原菌。我們前期對(duì)pvl基因亞型初步研究發(fā)現(xiàn)，引起SSTIs的CA-MRSA攜帶pvl基因比率較高，但不同菌株遺傳特征不明確[3]。因此，本研究檢測(cè)與分析了引起SSTIs的攜帶pvl基因CA-MRSA菌株(pvl+-CA-MRSA)的分子特征，以期更有效地預(yù)防、診斷和治療pvl+-CA-MRSA 所致SSTIs提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集浙江蕭山醫(yī)院就診為SSTIs患者標(biāo)本，采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，已分離鑒定的MRSA用PCR擴(kuò)增mecA基因再次確證，然后用30%甘油肉湯、-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。MRSA ATCC 49775(陽(yáng)性質(zhì)控)和MRSA N315(陰性質(zhì)控)為上海市第一人民醫(yī)院劉慶中博士惠贈(zèng)。CA-MRSA判讀標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]。

1.2 儀器和試劑 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma Scientific公司產(chǎn)品；Vitek 2 全自動(dòng)微生物鑒定儀購(gòu)自法國(guó)Bio-Merieux 公司并配套鑒定卡片GP和藥敏卡AST-GP67)。GeneAmp PCR System 9600為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，EPS-100 電泳儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品，UV-3B 紫外成像儀為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，CHEF-MAPPER脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品，Lysostaphin、Premix Taq Version 2.0和DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 研究方法

1.3.1 藥物敏感試驗(yàn) 采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌檢測(cè)分析系統(tǒng)及其AST-GP67 藥敏卡檢測(cè)CA-MRSA 菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性。

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA制備 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(美國(guó) Axygen)按說(shuō)明書(shū)提取CA-MRSA菌株基因組DNA，其中含有1 mg/mL溶葡萄球菌酶，紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度。

1.3.3pvl基因檢測(cè)與亞型確認(rèn) 參照文獻(xiàn)報(bào)道的PCR檢測(cè)CA-MRSA菌株中pvl基因[5]，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。按Boakes等[6]介紹的PCR采用3對(duì)引物分別擴(kuò)增654、718和680 bp不同亞型pvl基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序后參照O’Hara等[7]的方法判斷pvl基因亞型。

1.3.4 SCCmec分型 參照文獻(xiàn)采用多重PCR 檢測(cè)并確定pvl+-CA-MRSA菌株SCCmec類(lèi)型(Ⅰ-Ⅴ)[8]。MRSA ATCC49775(陽(yáng)性質(zhì)控)、SCCmec分型質(zhì)控菌株NCTC10442(Ⅰ型)、N315(Ⅱ型)、85/2082(Ⅲ型)、JCSC4744(Ⅳ型)和HS663(Ⅴ型)由上海市第一人民醫(yī)院劉慶中博士惠贈(zèng)。

1.3.5 序列類(lèi)型(STs)、克隆復(fù)合物(CCs)、金黃色葡萄球菌蛋白A(spa)和輔助基因調(diào)節(jié)子(agr)位點(diǎn)分型 根據(jù)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行STs/CCs分型。參照Enright等[9]介紹的方法，采用PCR擴(kuò)增arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL 7個(gè)靶基因，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mlst.net)分析確定其STs，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)(http://eburst.mlst.net/)中eBURST程序 (enhanced based upon related sequence types)進(jìn)行CCs分析。參照文獻(xiàn)用spa分型引物PCR檢測(cè)[10]，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后通過(guò)網(wǎng)站(http://www.ridom.de/spaserver/) 分析，獲得spa型別。agr分型采用文獻(xiàn)報(bào)道的多重PCR法[11]。

1.3.6 PFGE分型pvl+-CA-MRSA菌株DNA用限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ酶切和PFGE后，采用BioNemuerics 軟件對(duì)條帶模式進(jìn)行聚類(lèi)分析，相似度大于80%的條帶判為有密切相關(guān)性[12]。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1pvl基因檢出率及分布特征 本研究從SSTIs患者標(biāo)本中分離獲得92株CA-MRSA(頭孢西丁抑菌圈≤21 mm和mecA基因陽(yáng)性)，其中24株為pvl+-CA-MRSA，檢出率為26.1%(24/94)，其余68株為未攜帶pvl基因CA-MRSA (pvl--CA-MRSA)。24株pvl+-CA-MRSA中，男性患者13例、女性11例，平均年齡(24.5±19.0)歲。病種以皮膚膿腫為主(50%，12/24)，其次為外傷感染(45.8%,11/24)。不同年齡組患者中分離CA-MRSA的pvl陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.031，P>0.05)(表1)。

表1 不同年齡SSTIs患者中分離CA-MRSA的pvl陽(yáng)性率Tab.1 pvl positivity rates of CA-MRSA isolates from patients with SSTIs by age

2.2 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 除對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物(青霉素、苯唑西林和頭孢西丁)耐藥外，24株pvl+-CA-MRSA對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和慶大霉素的耐藥率分別為87.5%、62.5%、54.2%、16.7%、8.3% 和8.3%，未發(fā)現(xiàn)耐莫西沙星、利福平、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素的菌株(表2)。與68株pvl--CA-MRSA比較，pvl+-CA-MRSA菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥率較高(χ2=6.091，P<0.05)，但對(duì)其它抗菌藥物耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 CA- MRSA菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率Tab.2 Resistance rates of CA-MRSA isolates to various antibiotics

2.3pvl+-CA-MRSA分子特征 24株pvl+-CA-MRSA菌株中，H亞型23株(H1亞型3株、H2亞型20株)，R亞型(R2)1株；共鑒定出8種不同的STs和7種CCs，其中以ST59(62.5%，15/24)和CC59(70.8%，17/24)為主；SCCmec型別主要為III和IVa，分別占54.2%和33.3%；agr等位基因以agrI(87.5%，21/24)最常見(jiàn)，其余為agrIII，共檢出8種spa型，以t437型(66.7%，16/24)最為常見(jiàn)。因此，pvl+-CA-MRSA的優(yōu)勢(shì)克隆為pvlH2、ST59/CC59、SCCmecIII/IVa、agrI、t437(58.3%,14/24),見(jiàn)表3。

表3 24株pvl+-CA-MRSA菌株分子特征Tab.3 Molecular characteristics of 24 pvl+-CA-MRSA isolates

2.4 PFGE分型結(jié)果 24株分離自SSTIs患者標(biāo)本的pvl+-CA-MRSA可分為17種PFGE類(lèi)型(A-Q)其中A 型(A1-A4 亞型)4株、B 型(B1-B3 亞型)3株、C 型(C1-C2 亞型)2株、D型2株和E-Q型各1株。

3 討 論

SSTIs是化膿性致病菌侵犯表皮、真皮和皮下組織引起的炎癥性疾病，包括毛囊炎、癤、癰、淋巴管炎、急性蜂窩織炎、燒傷創(chuàng)面感染和褥瘡等。金黃色葡萄球菌是SSTIs的主要病原體，其產(chǎn)生的毒力因子如殺白細(xì)胞素(PVL)、α-溶血素、表皮脫落毒素、酚溶性調(diào)節(jié)蛋白等均與SSTIs嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。PVL可誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎癥因子與核因子κB，是壞死性SSTIs的重要毒力因子[14]。Meta分析結(jié)果顯示，PVL與深部SSTIs密切相關(guān)[15]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，pvl+金黃色葡萄球菌感染極易形成區(qū)域性社區(qū)傳播[16]。

PVL被認(rèn)為是鑒定CA-MRSA的標(biāo)志之一[17]。我們從SSTIs患者標(biāo)本中分離獲得的92株CA-MRSA菌株中，pvl陽(yáng)性率為24.6%，低于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的63.89%[18]、71.4%[19]和40%[20]，這可能與不同地區(qū)和人群差異性有關(guān)。pvl+金黃色葡萄球菌常引起蜂窩織炎和膿腫[21]。本研究中，50%pvl+-CA-MRSA菌株中分離自皮膚膿腫標(biāo)本，與報(bào)道一致。

由于地域和人群不同，所流行的pvl+-CA-MRSA分子特征可存在明顯差異。例如，美國(guó)為ST8/CC8-SCCmecⅣ、亞洲主要為ST59/CC59-SCCmecⅣ/V、印度為ST22-SCCmecⅣ和ST772-SCCmecⅤ型、歐洲為ST80/CC80-SCCmecⅣ、非洲為ST88-SCCmecⅣ型、澳大利亞為ST93/CC93-SCCmecⅣ[22-24]。本研究中分離自SSTIs的24株pvl+-CA-MRSA中，共鑒定出8種STs和7種CCs，但以ST59(62.5%)和CC59(70.8%)為主，SCCmec主要為III(54.2%)和IV型(33.3%)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道有較大差異。agr等位基因可分為Ⅰ-Ⅳ型，本研究中分離自SSTIs標(biāo)本的24株pvl+-CA-MRSA中以agrI(87.5%)最常見(jiàn)，其余為agrIII，未發(fā)現(xiàn)其它型別。此外，上述pvl+-CA-MRSA中共檢出8種spa型，以t437型(66.7%)最為常見(jiàn)。值得一提的是，pvl編碼基因易發(fā)生變異，根據(jù)第176位氨基酸種類(lèi)，可將pvl分為H和R亞型[7]，pvl亞型的分布數(shù)據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少，本研究中分離的24株pvl+-CA-MRSA以H2亞型為主(pvlH2)，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道不同[7]。上述24株pvl+-CA-MRSA的PFGE可檢出17種類(lèi)型(A-Q)共23 種帶型，顯示出明顯的多態(tài)性，說(shuō)明菌株進(jìn)化來(lái)源于多個(gè)克隆系，可能在進(jìn)化過(guò)程中存在較大變異。

我們的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，除對(duì)青霉素、苯唑西林、頭孢西丁等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥外，24株pvl+-CA-MRSA對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和慶大霉素的耐藥率分別為87.5%、62.5%、54.2%、16.7%、8.3% 和8.3%，未發(fā)現(xiàn)對(duì)莫西沙星、利福平、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素有耐藥性。有文獻(xiàn)報(bào)道,克林霉素、利奈唑胺和夫西地酸能在體外抑制MRSA時(shí)表達(dá)pvl[25]?？肆置顾睾屠芜虬肥羌?xì)菌蛋白質(zhì)合成的抑制劑，故可能抑制金黃色葡萄球菌結(jié)構(gòu)蛋白和酶類(lèi)的合成，即使在亞抑菌水平下，利奈唑胺也可使金黃色葡萄球菌更易被中性粒細(xì)胞吞噬[26]。然而，本研究中pvl+-CA-MRSA菌株對(duì)克林霉素有較高耐藥率(62.5%)，該抗生素已不適合用于pvl+-CA-MRSA引起的SSTIs治療，但上述菌株對(duì)利奈唑胺高度敏感，可作為治療pvl+-CA-MRSA引起的SSTIs首選藥物。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：應(yīng)曉波，張傳領(lǐng).引起皮膚軟組織感染的殺白細(xì)胞素陽(yáng)性社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子特征研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(9)：778-783.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.124