• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    兩種高通量測序平臺應(yīng)用于不同SARS-CoV-2變異株的對比研究

    2022-10-19 09:35:44李東曉馬紅霞王海峰黃學(xué)勇郭萬申
    中國人獸共患病學(xué)報 2022年9期
    關(guān)鍵詞:深度檢測

    李東曉,李 懿,朱 琳,宋 云,馬紅霞,王海峰,葉 瑩,黃學(xué)勇,郭萬申

    高通量測序,又名下一代測序(Next Generation Sequencing,NGS),可直接對人體臨床樣本中的核酸進行測序,實現(xiàn)對感染性疾病的檢測、分型及溯源,為促進分子流行病學(xué)研究和公共衛(wèi)生事件調(diào)查等多個方面提供助力[1]。新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)首次被發(fā)現(xiàn)就是基于二代測序的mNGS技術(shù),截止2022年2月,全球報告COVID-19確診病例超過4億[2-3]。為了實時監(jiān)測新型冠狀病毒的快速變異及演化規(guī)律,高通量測序技術(shù)在新型冠狀病毒的鑒定、分型、溯源方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,短讀長的二代測序一直是病原基因組學(xué)的金標準,三代測序作為新型快速診斷技術(shù),在實驗周期、成本及便攜性等方面扮演補充角色[4-5]。本文利用Illumina MiSeq和Oxford Nanopore兩種測序平臺分別對2021年境外輸入的4例COVID-19病例以及2022年本地6例COVID-19病例的上呼吸道樣本進行全基因組測序,對比分析這兩種測序平臺在新型冠狀病毒溯源分析研究中的特點。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源 10份上呼吸道樣本來自確診COVID-19的病例,采集時間為2021年6月至2022年1月,其中包括4例境外輸入病例、6例本地病例,樣本于-80 ℃保存。

    1.2 儀器與試劑 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(伯杰,中國上海);實時熒光定量PCR儀(LightCycler 96,瑞士羅氏公司);PCR擴增儀(BIO-RAD T100,美國伯樂公司);Qubit熒光定量儀(Qubit 3.0,美國賽默飛公司);高通量測序儀(Illumina MiSeq,美國Illumina公司);測序芯片(FLO-MIN106D,英國牛津納米孔公司);GridION Mk1測序儀(Oxford Nanopore,英國牛津納米孔公司)。

    1.3 建庫前處理 按核酸提取試劑盒說明書(天隆,中國西安)步驟進行核酸提取操作,得到10份樣本的總RNA。樣本S9和S10提取后的核酸用無核酸酶水進行梯度震蕩混勻稀釋并編號,樣本S9核酸稀釋為S11、S12、S13;樣本S10核酸稀釋為S14、S15、S16,所有核酸均用伯杰的新型冠狀病毒核酸檢測試劑進行熒光PCR檢測,樣本S9和S10的稀釋倍數(shù)及樣本編號見圖1。

    圖1 樣本S9和S10核酸稀釋處理流程Fig.1 Nucleic acid dilution processing steps (sample S9 and S10)

    1.4 二代測序全基因組文庫構(gòu)建和測序 采用北京微未來科技有限公司的新型冠狀病毒全基因組捕獲試劑盒(V-090418-1)將提取的病毒總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和特異性擴增。利用Invitrogen公司核酸定量分析試劑盒(Q32854,美國)對擴增后的cDNA進行定量,使用美國Illumina公司的Nextera XT文庫制備試劑盒(FC-131-1024)構(gòu)建測序文庫并進行磁珠純化(A63880,Beckman Coulter公司,美國),最后用Illumina公司的基因測序試劑盒(MS-102-2002,美國)在MiSeq測序儀進行全基因組測序。

    1.5 三代測序全基因組文庫構(gòu)建和測序 取樣本擴增純化后的cDNA進行核酸定量,取100 ng為模板,樣本S1、S7~S10依次按說明書使用英國牛津納米孔公司的連接測序試劑盒(SQK-LSK109)、無擴增條碼試劑盒(EXP-NBD114)進行建庫;樣本S2~S6使用牛津納米孔公司的快速建庫條碼測序試劑盒(SQK-RBK004,英國)制備文庫,利用牛津納米孔公司的測序引發(fā)試劑盒(EXP-FLP002,英國)對測序芯片預(yù)處理,加入待測文庫后,運行GridION基因測序儀進行全基因組測序。

    1.6 數(shù)據(jù)分析 以NCBI(National Center for Biotechnology Information)中SARS-CoV-2全基因組序列(Wuhan-Hu-1株,GenBank:MN908947)作為參考序列,使用德國凱杰公司的CLC Genomics Workbench 21.0軟件對測序原始下機數(shù)據(jù)進行序列拼接,得到的序列在Nextclade(https://clades.nextstrain.org/)和Pangolin(https://clades.nextstrain.org/)在線分析工具進行分型,運用MEGA-X軟件進行變異位點分析。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用美國IBM公司的SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,滿足正態(tài)性分布采用(均數(shù)±標準差)進行統(tǒng)計描述,不服從正態(tài)分布采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)進行統(tǒng)計描述。對10份樣本的二代測序和三代測序覆蓋度比較采用Wilcoxon秩和檢驗;8份樣本三代測序不同時間覆蓋度采用單因素方差分析的Welch分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 全基因組測序結(jié)果 10份樣本進行熒光定量PCR檢測,ORF1ab基因Ct值分布在13.2~30.98之間。10份樣本二代和三代測序分型結(jié)果一致,按照Pangolin分型法分為3個型別,S2、S3、S4為Omicron(BA.1)變異株,二代測序基因組序列全長29 873 bp,三代測序基因組全長29 873~29 882 bp;S9為Alpha(B.1.1.7)變異株,二代測序基因組全長29 869 bp,三代測序基因組全長29 868 bp;其余6份樣本均為Delta(B.1.617.2)變異株,二代測序基因組序列全長29 862~29 891 bp,三代測序基因組全長29 867~29 891 bp。二代和三代測序均分型成功,分型結(jié)果見表1。

    表1 10份樣本的全基因組序列分型Tab.1 Whole genome sequence typing of ten samples

    2.2 二代和三代測序序列對比 Illumina和Nanopore兩個測序平臺的覆蓋度顯示,樣本S7的二代測序覆蓋度最低(98.48%),其余樣本在兩個平臺的覆蓋度均能達到99%以上。二代測序覆蓋度中位數(shù)為99.73%(0.36%),三代測序覆蓋度中位數(shù)為99.90%(0.37%),10份樣本的二代和三代測序覆蓋度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.037,P<0.05)。Illumina平臺測序時長達24 h左右,平均測序深度(11 866.8±5 781.9);Nanopore平臺測序時間為6~21 h不等,平均測序深度為1 257.5(3 137)。二代測序樣本S4(Ct值:18.35)平均測序深度最高(19 209),樣本S1(Ct值:30.98)測序深度最低(4 151);三代測序樣本S10(Ct值:16.81)平均測序深度最高(4 410),樣本S6(Ct值:22.2)平均測序深度最低(533)。兩種測序平臺比較見表2。

    表2 兩種測序平臺覆蓋度及平均測序深度比較Tab.2 Comparison of coverage and mean sequencing depth between sequencing platforms

    2.3 不同變異株的變異位點分析 與參考基因組相比,Alpha變異株二代測序檢測到41個核苷酸變異位點;4份Delta變異株檢測到47個核苷酸變異位點,樣本S1檢測到42個,樣本S10檢測到35個;Omicron變異株分別檢測到55個、61個核苷酸變異位點。Alpha變異株S基因編碼區(qū)涉及到非同義突變有8個,Delta變異株涉及到的非同義突變9~11個,Omicron突變株涉及到的非同義突變30個。所有樣本均出現(xiàn)D614G的變異,位點變異情況詳見表3。

    表3 兩種測序平臺位點變異比較Tab.3 Comparison of nucleic acid and amino acid sequences between sequencing platforms

    表3(續(xù))樣本編號二代測序三代測序突變位點S編碼區(qū)核苷酸突變數(shù)S編碼區(qū)氨基酸突變位點突變位點S編碼區(qū)核苷酸突變數(shù)S編碼區(qū)氨基酸突變位點S74710T19R、T95I、G142D、R158G、L452R、T478K、T547I、D614G、P681R、D950N 4710同二代測序S84710T19R、T95I、G142D、R158G、L452R、T478K、T547I、D614G、P681R、D950N 4710同二代測序S9418V70I、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H418同二代測序S10359T19R、G142D、R158G、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N388T19R、G142D、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N

    2.4 不同稀釋度樣本二代和三代測序?qū)Ρ?Illumina平臺所有樣本的測序時間均相同,不同稀釋度的樣本平均測序深度和覆蓋度如表4所示,樣本S9和樣本S10為原樣,其余6份稀釋樣本的Ct值分布在22.69~35.37之間。測序覆蓋度最高的是樣本S9和S10(Ct值<20);平均測序深度最高的是樣本S11(Ct值:24.65)和樣本S14(Ct值:22.69);平均測序深度和覆蓋度均較低的樣本S13和S16,Ct值33~35之間。樣本S9、S11~S13的平均測序深度為11 359.5±7 664,樣本S10、S14~S16的平均測序深度為11 435.5±6 410.4;不同稀釋度樣本二代測序覆蓋度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.091,P>0.05)。

    表4 測序不同時間對比Tab.4 Sequencing comparison at various time points

    Nanopore三代測序過程中,分別在測序開始后的1、2、3、11 h拷貝數(shù)據(jù)并拼接分析,在Pangolin在線工具上進行分型,樣本S9、S11、S12、S13為B.1.1.7變異株,樣本S10、S14、S15、S16為B.1.617.2變異株。所有樣本測序2、3、11 h后分型,均與測序1 h的分型結(jié)果相同。

    測序1 h后,Ct值大于30的樣本S12、S13和S16的覆蓋度和平均測序深度與其他樣本相比均較低;測序2 h和3 h后,樣本S12的覆蓋度和平均測序深度有所提升;三代測序超過11 h后,樣本S13和S16覆蓋度分別達到99.90%和99.83%,平均測序深度分別達到254和163,在所有樣本中測序深度最低,其他6個樣本平均測序深度均大于2 000。三代測序4個不同時間的覆蓋度中位數(shù)為99.17%(2.36%)、99.89%(1.77%)、99.91%(0.47%)、99.93%(0.07%),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.498,P>0.05)。

    3 討 論

    目前,WHO一共公布了5種需關(guān)注的變異株(VOC),它們分別是:Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)。Omicron變異株較其它變異株突變位點更多,有更強的傳染性和免疫逃逸能力[6],截至2022年2月,Omicron變異株已經(jīng)至少在142個國家或地區(qū)流行,逐漸取代Delta株成為優(yōu)勢毒株[7]。隨著新型冠狀病毒在全球的不斷傳播,新冠肺炎病例不斷攀升,新的變種不斷出現(xiàn),研究表明,新型冠狀病毒基因組每月積累兩個單堿基突變[8-9]。基因組監(jiān)測的大規(guī)模應(yīng)用將有利于更早預(yù)測并啟動公共衛(wèi)生策略,遏制SARS-CoV-2變異株及其他新型病毒的暴發(fā)[10-11]。

    本研究發(fā)現(xiàn),針對同一樣本,Illumina二代測序和Nanopore三代測序在覆蓋度方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義,均能獲得3種新冠病毒變異毒株的基因序列并準確分型。6份樣本S3、S4、S5、S7、S8和S9變異位點保持一致,樣本S1、S2的三代測序變異位點總數(shù)少于二代測序,樣本S6和S10三代測序變異位點數(shù)目多于二代測序。樣本S1的Ct值為30.98,推測原始樣本中病毒部分基因片段數(shù)目較少,三代測序測序深度不足導(dǎo)致檢測到的變異位點減少。樣本S2為Omicron變異株,變異位點較多,S基因編碼區(qū)擴增效率不高,加之三代平均測序深度(812)遠低于二代測序(14 931),變異位點檢測總數(shù)比二代測序少。樣本S6的三代測序比二代測序突變位點總數(shù)多2個,分別是ORF1ab編碼區(qū)T15510C(339C:10T)、N基因編碼區(qū)G28796A(655A),未引起氨基酸改變。樣本S10的三代測序比二代測序突變位點總數(shù)多3個,ORF1ab編碼區(qū)T6552G,對應(yīng)氨基酸替換M2096R;編碼區(qū)A18675G、C18676T、T18678C、T18690G為插入缺失,造成2個氨基酸替換R6138C、F6142L。Nanopore單分子測序技術(shù)的錯誤率主要集中在插入缺失,不過這些錯誤是隨機出現(xiàn)的,足夠高的覆蓋率能在一定程度上彌補該錯誤率[12]。

    S基因編碼區(qū)突變位點對比發(fā)現(xiàn),樣本S3~S9共7份樣本的變異位點數(shù)目在兩個平臺保持一致,3份樣本(S1、S2、S10)變異位點數(shù)目不同,三代測序變異位點檢測數(shù)目少,二代測序?qū)ψ儺愇稽c的識別更多更精確。針對S基因編碼區(qū)變異位點不同的樣本分析,樣本S1缺少5個氨基酸變異位點,S基因編碼區(qū)增加1個氨基酸變異位點(V267L),對應(yīng)的核苷酸變異位點G22361T,該位置為雜合位點(2G:3T),因測序深度太低未納入分析;樣本S2和S10三代測序檢測的變異位點數(shù)均少于二代測序,對應(yīng)的氨基酸突變數(shù)目也相應(yīng)減少。

    為評價Ct值對于測序效果的影響,同時對比不同變異株之間測序有無差別,我們選擇兩種變異株樣本S9(Alpha變異株)和樣本S10(Delta變異株),對核酸進行梯度稀釋后測序。這兩份樣本原始Ct值在20以下,通過不斷稀釋,樣本中的病毒載量不斷減少,測序結(jié)果顯示,這8份樣本在Illumina二代測序和Nanopore三代測序平臺的覆蓋度差異無統(tǒng)計學(xué)意義;同一樣本不同稀釋度在兩個平臺的分型結(jié)果保持一致;Ct值33~35的樣本,二代測序和三代測序平均測序深度均較低。L?vestad AH等采用Nanopore平臺對新型冠狀病毒三代測序的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),Ct值<33的樣本能夠保證一致的擴增效率和較高的基因組覆蓋度[13]。本次研究16份核酸樣本Ct值在13.20~35.37,Ct值<33的樣本在二代和三代測序平臺均能獲得較好的測序結(jié)果,證實了以上結(jié)論。Lu等[14]的研究也發(fā)現(xiàn),對于Ct值30以上的病毒載量較低的樣本,三代測序覆蓋度優(yōu)于二代測序。與短讀長的二代測序相比,三代測序的長讀長可能更有利于基因組組裝和結(jié)構(gòu)變異檢測[15]。

    Nanopore三代測序采用實時測序的單分子測序技術(shù),實時產(chǎn)出、實時分析是區(qū)別于二代的最大特點,對于突發(fā)傳染病應(yīng)急檢測具有非常重要的作用。對于Ct值<33的樣本,三代測序1 h后,平均測序深度達到300以上即可在兩個分型平臺完成分型,且與之后的分型結(jié)果保持一致;Ct值>33的樣本,平均測序深度200左右也可以準確分型。從測序成本角度考慮,Ct值較大的樣本,隨著測序時間延長,新冠病毒基因組大部分序列已被覆蓋,一味追求測序深度意義不大,建議測序數(shù)據(jù)能夠拼接分型后停止測序。根據(jù)測序芯片不同,Illumina二代測序時間在18~24 h,Nanopore三代測序?qū)⒋蟠筇嵘龖?yīng)急檢測速度。本研究同時對比了Nanopore連接法和快速法測序效果,連接法的建庫時間約4 h,測序速度快、深度更高,1 h可以滿足分析需求;快速法的優(yōu)點在于無需純化,建庫時間短(20 min),SARS-CoV-2全基因組序列最快2 h內(nèi)獲得,但5個樣本測序深度總體不高,產(chǎn)生測序數(shù)據(jù)速度慢。實際工作中快速法更適合長片段序列,連接法適合短片段序列,這兩種建庫方法也為三代測序提供更多選擇。

    本研究中Nanopore三代測序的主要限制因素在于變異位點檢測數(shù)目較Illumina二代測序少,以及部分插入缺失,相信隨著三代測序的大規(guī)模推廣應(yīng)用,測序技術(shù)及糾錯軟件的不斷優(yōu)化,數(shù)據(jù)準確度的不足必將會得到彌補[16]。對16份樣本的全基因組測序中,Nanopore三代測序憑借速度快、分型準確等優(yōu)點,能夠在疫情暴發(fā)的初期迅速鑒別新冠病毒;Illumina二代測序錯誤率低,測序數(shù)據(jù)更加可信,這兩種測序技術(shù)從不同應(yīng)用層面為疫情風(fēng)險評估、流行病學(xué)監(jiān)測及公共衛(wèi)生決策提供技術(shù)保證。本研究也有一定的局限性,如樣本量較少未能全面反應(yīng)總體狀況,結(jié)論的適用程度有待擴充等,但本研究可為后續(xù)新冠病毒全基因組測序工作開展提供參考。

    利益沖突:無

    引用本文格式:李東曉,李懿,朱琳,等.兩種高通量測序平臺應(yīng)用于不同SARS-CoV-2變異株的對比研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(9):771-777.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.122

    猜你喜歡
    深度檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    深度理解一元一次方程
    深度觀察
    深度觀察
    深度觀察
    深度觀察
    亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 99riav亚洲国产免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 手机成人av网站| 高清欧美精品videossex| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲五月婷婷丁香| 男女床上黄色一级片免费看| 99国产极品粉嫩在线观看| av免费在线观看网站| 人人澡人人妻人| 欧美成人免费av一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 久久99一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线观看一区二区三区激情| 岛国在线观看网站| 久久 成人 亚洲| 色尼玛亚洲综合影院| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲全国av大片| 国产亚洲精品一区二区www| av天堂久久9| 一级片'在线观看视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲久久久国产精品| av中文乱码字幕在线| 国产成人欧美| 午夜激情av网站| 丁香六月欧美| 久久青草综合色| 国产片内射在线| av片东京热男人的天堂| 免费高清在线观看日韩| 美女午夜性视频免费| 999久久久精品免费观看国产| www国产在线视频色| 亚洲第一av免费看| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲精品一区av在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 最新在线观看一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美日韩视频精品一区| 亚洲七黄色美女视频| 大陆偷拍与自拍| 男女床上黄色一级片免费看| 深夜精品福利| 亚洲精品在线观看二区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| svipshipincom国产片| 精品久久蜜臀av无| 国产精品秋霞免费鲁丝片| a在线观看视频网站| 久久亚洲真实| 午夜福利免费观看在线| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲五月色婷婷综合| 国产免费男女视频| 中文字幕av电影在线播放| 午夜久久久在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 久久性视频一级片| 一级片免费观看大全| 在线看a的网站| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 精品乱码久久久久久99久播| 美女午夜性视频免费| 在线视频色国产色| 在线视频色国产色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 身体一侧抽搐| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线观看日韩欧美| 日本一区二区免费在线视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| tocl精华| 一区在线观看完整版| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 两性夫妻黄色片| 成年人黄色毛片网站| 久久久久国内视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久久久久久久大奶| 国产成人精品无人区| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲第一青青草原| 国产真人三级小视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 天天添夜夜摸| 在线天堂中文资源库| 18禁国产床啪视频网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品影院久久| 午夜视频精品福利| 97碰自拍视频| 国产高清视频在线播放一区| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老汉色∧v一级毛片| 动漫黄色视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 成人国产一区最新在线观看| 乱人伦中国视频| 亚洲美女黄片视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 黄片小视频在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| a级片在线免费高清观看视频| av天堂在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜视频精品福利| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲三区欧美一区| 亚洲熟女毛片儿| 岛国在线观看网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 国产亚洲av高清不卡| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美性长视频在线观看| 国产视频一区二区在线看| 欧美成人午夜精品| 男人舔女人的私密视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美乱码精品一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 美国免费a级毛片| 九色亚洲精品在线播放| 在线观看66精品国产| 欧美一区二区精品小视频在线| 三上悠亚av全集在线观看| av中文乱码字幕在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 90打野战视频偷拍视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲中文av在线| 亚洲中文av在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲av第一区精品v没综合| 天堂中文最新版在线下载| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久人妻熟女aⅴ| 男女之事视频高清在线观看| 日韩欧美免费精品| 欧美激情高清一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜亚洲福利在线播放| 免费观看人在逋| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲精华国产精华精| 免费看十八禁软件| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品日产1卡2卡| 一级片'在线观看视频| 日本三级黄在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 丝袜美足系列| 色婷婷久久久亚洲欧美| 水蜜桃什么品种好| 国产视频一区二区在线看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美在线黄色| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99riav亚洲国产免费| 久久性视频一级片| 极品人妻少妇av视频| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品永久免费网站| 久久久久久久久免费视频了| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 精品久久久精品久久久| 成年版毛片免费区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天堂动漫精品| 欧美在线一区亚洲| 国产欧美日韩一区二区精品| www国产在线视频色| 人人澡人人妻人| 午夜福利影视在线免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 超碰97精品在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黑丝袜美女国产一区| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成人精品无人区| 久99久视频精品免费| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 18禁美女被吸乳视频| 国产av又大| 校园春色视频在线观看| 色播在线永久视频| 亚洲欧美激情在线| 丝袜在线中文字幕| 午夜影院日韩av| 黄色女人牲交| 美女高潮到喷水免费观看| 久久人妻熟女aⅴ| 一区二区三区精品91| 欧美成人性av电影在线观看| 黄片大片在线免费观看| 成人三级做爰电影| 欧美性长视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 黄片小视频在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 无人区码免费观看不卡| 成熟少妇高潮喷水视频| av国产精品久久久久影院| 久久国产精品影院| 天天影视国产精品| videosex国产| 欧美色视频一区免费| 国产高清国产精品国产三级| 看黄色毛片网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产色视频综合| 久久久国产一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲色图av天堂| av天堂在线播放| 99国产精品免费福利视频| 99riav亚洲国产免费| 国产国语露脸激情在线看| 多毛熟女@视频| 国产亚洲精品一区二区www| 天堂俺去俺来也www色官网| 啦啦啦免费观看视频1| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 这个男人来自地球电影免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 怎么达到女性高潮| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 涩涩av久久男人的天堂| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲国产欧美一区二区综合| 桃色一区二区三区在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费在线观看影片大全网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久午夜亚洲精品久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一区二区三区国产精品乱码| 曰老女人黄片| 波多野结衣高清无吗| 黄片小视频在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜福利在线观看吧| bbb黄色大片| av片东京热男人的天堂| 日韩欧美在线二视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 满18在线观看网站| 久久九九热精品免费| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av中文乱码字幕在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 美女 人体艺术 gogo| 久久国产精品人妻蜜桃| 超碰成人久久| 好男人电影高清在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本a在线网址| 美女 人体艺术 gogo| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品国产高清国产av| 国产精品影院久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 夜夜爽天天搞| av片东京热男人的天堂| 黄色怎么调成土黄色| 9热在线视频观看99| 新久久久久国产一级毛片| 天堂√8在线中文| 欧美成人性av电影在线观看| 日本wwww免费看| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品国产区一区二| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 老司机深夜福利视频在线观看| ponron亚洲| a级片在线免费高清观看视频| 久久久久九九精品影院| 正在播放国产对白刺激| 国产精品免费视频内射| 午夜福利一区二区在线看| 免费人成视频x8x8入口观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 女性被躁到高潮视频| 国产高清激情床上av| 久久久久久久久久久久大奶| 中出人妻视频一区二区| 在线观看舔阴道视频| 亚洲专区中文字幕在线| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲人成电影免费在线| 中文字幕av电影在线播放| 97碰自拍视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜免费激情av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜福利欧美成人| а√天堂www在线а√下载| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久国产欧美日韩av| 俄罗斯特黄特色一大片| 天堂影院成人在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久9热在线精品视频| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲欧美激情在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩有码中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人三级做爰电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品久久久人人做人人爽| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品人妻1区二区| 国产av精品麻豆| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 无限看片的www在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费看十八禁软件| 黄色怎么调成土黄色| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久精品人人爽人人爽视色| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av电影中文网址| 久久国产精品男人的天堂亚洲| cao死你这个sao货| 最新美女视频免费是黄的| 悠悠久久av| 国产一区二区激情短视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 69精品国产乱码久久久| netflix在线观看网站| 亚洲国产精品sss在线观看 | 久久久久九九精品影院| 欧美久久黑人一区二区| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 啦啦啦在线免费观看视频4| 999久久久国产精品视频| 亚洲人成77777在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久久国产欧美日韩av| 满18在线观看网站| 夫妻午夜视频| 在线观看www视频免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 女人被狂操c到高潮| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品国产av在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲激情在线av| 99在线视频只有这里精品首页| 国产1区2区3区精品| www.自偷自拍.com| 国产伦人伦偷精品视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 天堂√8在线中文| 欧美黄色淫秽网站| 午夜激情av网站| 亚洲久久久国产精品| 性少妇av在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本黄色日本黄色录像| 少妇的丰满在线观看| 午夜激情av网站| 天堂√8在线中文| 精品一区二区三区四区五区乱码| 激情在线观看视频在线高清| 男女床上黄色一级片免费看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 999久久久国产精品视频| 欧美日韩乱码在线| 久久伊人香网站| 色哟哟哟哟哟哟| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产av一区在线观看免费| 999久久久国产精品视频| 满18在线观看网站| 亚洲情色 制服丝袜| 精品人妻1区二区| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久久久久免费视频 | 日韩欧美一区视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产熟女xx| 久久天堂一区二区三区四区| 麻豆国产av国片精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 天堂中文最新版在线下载| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲伊人色综图| 久久久久国内视频| 91在线观看av| 国产免费av片在线观看野外av| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久天堂一区二区三区四区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 手机成人av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲三区欧美一区| 日韩视频一区二区在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆av在线久日| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 国产成人av教育| 国产精品98久久久久久宅男小说| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av片天天在线观看| 天堂√8在线中文| 婷婷丁香在线五月| 黄色 视频免费看| 一夜夜www| 欧美最黄视频在线播放免费 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲成人久久性| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av成人av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲成人精品中文字幕电影 | 9色porny在线观看| 亚洲自拍偷在线| 操出白浆在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成人精品久久二区二区91| 一级毛片高清免费大全| 18禁国产床啪视频网站| 国产亚洲欧美精品永久| www.自偷自拍.com| 国产成人影院久久av| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲avbb在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利,免费看| 午夜成年电影在线免费观看| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩一级在线毛片| 在线观看www视频免费| 国产精品久久视频播放| 色老头精品视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美日韩av久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久久久久中文| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 精品一区二区三卡| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品91蜜桃| 亚洲精华国产精华精| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成人av一区二区三区在线看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 99re在线观看精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 动漫黄色视频在线观看| 免费看十八禁软件| 欧美日韩av久久| 在线看a的网站| 无限看片的www在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 怎么达到女性高潮| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美大码av| 午夜免费观看网址| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲美女黄片视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成年人黄色毛片网站| 亚洲熟女毛片儿| 电影成人av| 欧美日韩av久久| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕高清在线视频| 成年人免费黄色播放视频| 两个人看的免费小视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 久久久精品欧美日韩精品| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日日夜夜操网爽| www.999成人在线观看| xxx96com| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲avbb在线观看| 国产xxxxx性猛交| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 涩涩av久久男人的天堂| e午夜精品久久久久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品国产一区二区久久| ponron亚洲| 成人黄色视频免费在线看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 嫁个100分男人电影在线观看| 麻豆成人av在线观看| 国产黄色免费在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产成人精品无人区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品亚洲一级av第二区| 久久精品91无色码中文字幕| 老司机在亚洲福利影院| 精品福利永久在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黄频高清免费视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 性色av乱码一区二区三区2| 99国产精品一区二区三区| 满18在线观看网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| av网站免费在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 黄片大片在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 99riav亚洲国产免费| 亚洲熟女毛片儿| 成人手机av| 午夜视频精品福利| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产成人系列免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲国产看品久久| 高清在线国产一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费观看精品视频网站| videosex国产| 无限看片的www在线观看| 69av精品久久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女 |