舒肝和絡(luò)醒脾方對肝纖維化模型大鼠肝組織Wnt/β-Catenin信號通路的影響

王奎淞， 張秋菊， 魏書瑤， 殷世鵬， 李婕妠， 陳世玉， 郭嘉琪， 趙鯤鵬

甘肅中醫(yī)藥大學(xué) a.中醫(yī)臨床學(xué)院， b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， c.公共衛(wèi)生學(xué)院， d.圖書館古籍部， 蘭州 730000

肝纖維化是各種慢性肝損傷導(dǎo)致的肝內(nèi)膠原纖維異常增生的病理過程，是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。由于其形成機(jī)制十分復(fù)雜，目前在臨床上尚無理想的、公認(rèn)的抗纖維化特效藥物[1]。中藥復(fù)方湯劑具有經(jīng)多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點，在抗肝纖維化治療中具有獨特優(yōu)勢。甘肅省國醫(yī)大師周信有教授將肝纖維化“細(xì)胞外基質(zhì)沉積(肝損傷)-肝纖維化特征性改變(纖維化)-大量假小葉形成(肝硬化)”過程提煉為中醫(yī)學(xué)“絡(luò)脈瘀滯-微小癥積-癥積形成”理論，提出“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說，并基于此結(jié)合臨床驗效擬舒肝和絡(luò)醒脾方，具有舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血之功效[2]。

Wnt/β-Catenin是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化功能的Wnt家族經(jīng)典蛋白信號通路，當(dāng)該信號通路被激活后，可以調(diào)節(jié)許多器官的纖維化發(fā)展過程，與肝纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。且該通路Wnt1/β-Catenin/Cyclin D1導(dǎo)致肝纖維化形成的機(jī)理與“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說不謀而合。故本研究旨在觀察舒肝和絡(luò)醒脾方對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的治療作用，并探討其是否通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮影響，驗證“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性，并為該復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性6周齡SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃，濕度50%～65%的12 h光暗循環(huán)環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(甘)2020-0001，實驗動物使用許可證編號：SYXK(甘)2020-0009。

1.1.2 藥物及制備 舒肝和絡(luò)醒脾方組成：醋柴胡10 g、岷當(dāng)歸15 g、炙黃芪12 g、莪術(shù)12 g、鱉甲10 g、枳椇子10 g，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。灌胃藥劑采用水提法將各單味藥物按臨床用藥比例混合制備：(1)加5倍量水不浸泡，回流提取0.5 h，趁熱過濾；(2)藥渣再加4倍量水回流提取0.5 h，趁熱過濾，并將濾液合并；(3)高劑量組濃縮至每1 mL含生藥1.24 g，低劑量組稀釋至每1 mL含生藥0.31 g[4]。陽性對照組藥物選用水飛薊賓葡甲胺片(江蘇中興藥業(yè)有限公司，批號：H32026145，0.5 mg/片)。

1.1.3 試劑及耗材 食用玉米油(上海益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司，生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)號：SC10161048100337)；CCl4分析純(恒興試劑，批號：20120211)；HE染色試劑盒(Solarbio，批號：G1120)；Masson染色試劑盒(Solarbio，批號：G1343)；RIPA裂解液(Solarbio，批號：20200730)；BCA試劑盒(Solarbio，批號：20200817)；羥脯氨酸(HYP)堿水解法檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號A030-2-1)；AST、ALT、Alb和總蛋白使用全自動生化儀配套試劑檢測(ROCHE，批號：56902901，57938901，57927501，57378001)；Wnt1兔抗單克隆抗體(GeneTex，批號：GTX105955)；β-Catenin兔抗單克隆抗體(GeneTex，批號：GTX101435)；Cyclin D1兔抗單克隆抗體(GeneTex，批號：GTX108624)；GAPDH兔抗多克隆抗體(ImmunoWay，批號：YM3215)；ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(YEASEN，批號：S2018081)；RNA純化試劑盒(TaKaRa，批號：9767)；熒光定量試劑盒(TaKaRa，批號：RR820A)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，批號：RR047A)。

1.1.4 主要儀器 全自動組織脫水切片機(jī)(Leica Biosystems，CM3050S)；顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS，BX53)；全自動生化分析儀(ROCHE，COBAS C311)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，CFX96)；電泳儀(BIO-RAD，041BR 109973)；全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad，Trans-Blot Turbo)；全能型成像系統(tǒng)(Bio-Rad ，Chemi Doc MP)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Mark1509)，精密電子天平(OHAUS，AR224CN)。

1.2 動物分組、造模及藥物干預(yù) 60只Wistar大鼠使用簡單隨機(jī)化分組法分為空白對照組、模型組、陽性對照組和舒肝和絡(luò)醒脾方高、中、低劑量組6組，每組10只。分組法如下操作：(1)將60只大鼠從1～60編號；(2)繪制隨機(jī)數(shù)字表，從數(shù)字表中任意數(shù)字開始，以同一方向順序得到每只大鼠的隨機(jī)數(shù)字；(3)隨機(jī)數(shù)除以組數(shù)求余數(shù)，整除則余數(shù)取組數(shù)；(4)按余數(shù)分組；(5)調(diào)整[5]。分組后，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射1.0 mL/kg的40%CCl4玉米油溶液，每周2次，持續(xù)8周[6]。肝纖維大鼠模型成功的標(biāo)志為：肝組織HE切片能觀察到明顯纖維間隔形成[7]?？瞻讓φ战M和模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，陽性對照組用水飛薊賓葡甲胺溶液50 mg/kg灌胃，舒肝和絡(luò)醒脾方高、中、低劑量組分別按12.42 g/kg、6.21 g/kg和3.11 g/kg(生藥/體質(zhì)量)灌胃，每日1次，持續(xù)8周。給藥量計算方法參照《實驗藥理方法學(xué)》[8]，大鼠劑量=人臨床劑量/70 kg×6.3。末次給藥后次日，大鼠以45 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。腹主動脈穿刺取血后，離心取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ诟斡胰~切取肝組織(1 cm×1 cm×1 cm)浸于4%多聚甲醛固定液中做預(yù)切片處理；取肝左葉組織(1 cm×1 cm×1 cm)用于提取總蛋白和總RNA。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠生理狀況的觀察 每日觀察大鼠生長、進(jìn)食、飲水、毛色、糞便、尿量及顏色、活動、死亡情況。使用精密電子天平每周稱量并記錄各大鼠體質(zhì)量。

1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)檢測 取大鼠腹主動脈血血清用堿水解比色法檢測大鼠血清中HYP含量，于全自動生化分析儀檢測大鼠AST、ALT、總蛋白、Alb指標(biāo)水平。

1.3.3 肝組織病理學(xué)觀察 取甲醛固定的部分肝臟脫水、石蠟包埋、切片后做常規(guī)HE染色與Masson染色。常規(guī)HE染色評估采用鏡下觀察方法，每張切片選取3個不同視野，觀察纖維化程度，綜合參考臨床肝炎分級和肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)對肝臟損傷程度進(jìn)行評分，評分越高代表肝纖維化程度越嚴(yán)重(表1)[1]。

表1 慢性肝炎分級和肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)

Masson染色切片評估采用膠原容積分?jǐn)?shù)半定量分析法。每張切片選取3個不同視野，使用Image-pro Plus 6.0軟件選取相同的綠色作為判斷所有照片膠原纖維的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，分析得出膠原纖維占整個組織面積的比率即膠原纖維的面積百分比(%)[9]。

1.3.4 RT-qPCR法檢測肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的表達(dá) 取肝組織100 mg，液氮速凍后研磨，使用RNA純化試劑盒提取總RNA，RT-q PCR檢測Wnt1，β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，按qPCR試劑盒說明書擴(kuò)增。根據(jù) qPCR所得的Ct值，以β-actin為內(nèi)參計算2-ΔΔCt，計算結(jié)果以空白對照組表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。PCR引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成(表2)。

1.3.5 Western blot法檢測肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表達(dá) 取肝組織100 mg，粗剪碎加入RIPA裂解液，經(jīng)4 ℃低溫高速離心機(jī)12 000 r/min，30 min離心后取上清液進(jìn)行BCA法蛋白濃度測定以計算上樣量后加入4×loading buffer 上樣緩沖液，使用振蕩恒溫金屬浴100 ℃煮沸10 min變性。根據(jù)Western blot標(biāo)準(zhǔn)操作步驟依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育Wnt1(1∶2000)、β-Catenin(1∶2000)、Cyclin D1(1∶2000)和內(nèi)參蛋白GAPDH(1∶2000)，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像，使用Image J與GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1及GAPDH 顯影條帶的相對灰度值分析。

表2 PCR引物列表

2 結(jié)果

2.1 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠生理狀況的影響 造模過程中，空白組大鼠無死亡，余10只；模型組死亡4只，余6只；陽性對照組死亡1只，余9只；舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組死亡1只，余9只；舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組死亡2只，余8只；舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組死亡3只，余7只。經(jīng)觀察，空白對照組大鼠，體質(zhì)量正常，皮毛光澤，食量正常，活動靈敏，健康狀況良好。模型組大鼠明顯消瘦，體質(zhì)量減輕，毛色暗淡，精神不佳，進(jìn)食進(jìn)水少，糞便溏稀，尿色發(fā)黃。陽性對照組與舒肝和絡(luò)醒脾方組大鼠精神狀態(tài)尚可，活動度有所增加，反應(yīng)較快，進(jìn)食、飲水、毛色、糞便、尿量及皮毛光澤度有所改善，其中舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量組效果較為明顯。

2.2 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織血液學(xué)指標(biāo)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平顯著升高(P值均<0.05)，總蛋白、Alb和Alb/Glo(A/G)水平明顯降低(P值均<0.05)，提示造模成功。與模型組比較，陽性對照組和舒肝和絡(luò)醒脾方干預(yù)后大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平顯著降低(P值均<0.05)，總蛋白、Alb和A/G水平明顯升高(P值均<0.05)；與陽性對照組比較，舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組的ALT、 AST水平顯著升高(P值均<0.05)，總蛋白、Alb和A/G水平明顯降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示，舒肝和絡(luò)醒脾方和水飛薊賓葡甲胺對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的肝損傷具有保護(hù)作用，對大鼠的膠原蛋白分解代謝功能具有促進(jìn)作用，且提示水飛薊賓葡甲胺效果比舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量顯著，但舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量效果與水飛薊賓葡甲胺基本等效(表3、4)。

2.3 舒肝和絡(luò)醒脾方對肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化的影響及肝損傷程度評分 HE染色顯示：空白對照組大鼠肝臟分為6葉，色暗紅，邊角銳利，質(zhì)地柔軟；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索及肝竇圍繞中央靜脈呈放射狀排列；模型組大鼠肝臟顏色變淺，邊角變鈍，質(zhì)地變韌，并出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)，可見門靜脈中度纖維化伴大量纖維間隔，肝小葉內(nèi)纖維結(jié)締組織彌漫增生形成纖維間隔，小葉周圍及匯管區(qū)可見變性壞死的肝細(xì)胞，形成假小葉；與模型組比較，各用藥組大鼠肝臟纖維結(jié)締組織增生、分割明顯減輕，肝小葉輪廓相對清晰，肝細(xì)胞變性壞死程度減輕，肝臟形態(tài)、顏色和質(zhì)地接近正常；陽性對照組可見門靜脈輕度纖維化伴少量纖維間隔，肝細(xì)胞輕微脂肪變；舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組可見明顯門靜脈纖維化伴少量纖維間隔；舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組可見少量門靜脈輕微纖維化；舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組未觀察到明顯異常(圖1，表5)。Masson染色顯示：空白對照組僅匯管區(qū)血管有少量膠原沉積；模型組肝組織門靜脈中度纖維化伴大量纖維間隔，匯管區(qū)可見明顯纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，并形成假小葉，膠原沉積顯著增多(P<0.05)；與模型組比較，舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組雖然能有效減少膠原沉積(P<0.05)，但仍可觀察到明顯的門靜脈纖維化伴少量纖維間隔和假小葉，其余各藥物干預(yù)組纖維化程度均明顯減輕，膠原沉積顯著減少(P<0.05)；與陽性對照組比較，舒肝和洛醒脾方高劑量組膠原沉積的治療效果方面優(yōu)于水飛薊賓葡甲胺組舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量組(P值均<0.05)，與舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組基本等效(圖2，表6)。上述結(jié)果提示，舒肝和絡(luò)醒脾方能夠明顯改善肝纖維化大鼠肝組織病理改變及纖維化程度。舒肝和絡(luò)醒脾和低劑量具有輕微藥效作用，舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量和水飛薊賓葡甲胺具有一定治療作用，舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量具有明顯藥效作用。

2.4 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA水平的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1mRNA表達(dá)水平顯著升高(P值均<0.05)；與模型組比較，各藥物治療組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的水平顯著降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示，水飛薊賓葡甲胺和舒肝和絡(luò)醒脾方對于調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路的關(guān)鍵配體Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平有顯著作用，且各藥物治療組效果無明顯差異(表7)。

表3 各組HYP、ALT、AST表達(dá)水平比較

表4 各組TP、Alb、Glo和A/G表達(dá)水平比較

注：a,正常對照組；b,模型組；c,陽性對照組；d,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組；e,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組；f,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

注：a,正常對照組；b,模型組；c,陽性對照組；d,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組；e,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組；f,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

2.5 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P值均<0.05)；與模型組比較，除舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組外，其余各治療組肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P值均<0.05)；與陽性對照組比較，舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量組在β-Catenin蛋白水平表達(dá)上顯著升高(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示，水飛薊賓葡甲胺和舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量能夠抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平，且提示水飛薊賓葡甲胺與舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量對于該通路關(guān)鍵蛋白 β-Catenin調(diào)控作用優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量(圖3，表8)。

表5 各組HE染色切片分級及評分

表6 各組Masson染色切片肝纖維化分級及膠原容積分?jǐn)?shù)半定量分析結(jié)果

表7 各組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 mRNA 的表達(dá)

表8 各組大鼠組織Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 蛋白表達(dá)水平比較

注：空白，空白對照組；模型，模型組；陽性，陽性對照組；高，舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組；中，舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組；低，舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

3 討論

肝纖維化是所有慢性肝病共同的病理基礎(chǔ)。臨床上，肝硬化導(dǎo)致的腹水、上消化道出血、肝衰竭、肝細(xì)胞癌等均為肝纖維化的顯性表達(dá)。雖然肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但主要是由于“慢性肝損傷-促靜息肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外過度沉積的發(fā)生-導(dǎo)致肝纖維化病理變化”。肝纖維化于中醫(yī)屬“脅痛”“積聚”“肝著”等病癥范疇。甘肅省國醫(yī)大師周信有教授基于“肝藏血”“脾統(tǒng)血”“久病入絡(luò)”和“肝體陰用陽”理論，將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“慢性肝損傷-肝纖維化-肝硬化形成”疾病進(jìn)展提煉為中醫(yī)學(xué)“絡(luò)脈瘀滯-微小癥積-癥積形成”的理論，提出“益氣養(yǎng)血、祛瘀活絡(luò)、舒肝醒脾”的治療大法，即“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說，且結(jié)合臨床驗效擬專方舒肝和絡(luò)醒脾方。該方由醋柴胡，岷當(dāng)歸，炙黃芪，莪術(shù)，鱉甲，枳椇子六味藥構(gòu)成，以醋柴胡舒肝行氣，岷當(dāng)歸養(yǎng)血和絡(luò)，炙黃芪益氣扶正，鱉甲去痞除癥，莪術(shù)破血通絡(luò)，枳椇子醒脾解毒，共奏舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血之功效。針對肝纖維化絡(luò)脈瘀滯、肝郁脾困，氣血失和，進(jìn)而形成微小癥積的病機(jī)和證候要素，辨證施治，臨床確有良效[10]。臨床研究[11-13]表明，該方能夠有效改善肝纖維化患者臨床癥狀，并促進(jìn)肝功能恢復(fù)。已完成的基礎(chǔ)研究[4]證實，舒肝和絡(luò)醒脾方能夠顯著降低CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原和肝瞬時彈性成像指數(shù)水平，以發(fā)揮抗纖維化治療作用。

由于無論是肝纖維化發(fā)病的分子機(jī)制，還是Wnt/β-Catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制均暗合“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的學(xué)術(shù)思想，為了進(jìn)一步揭示舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化機(jī)制，印證“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性，本課題組檢測了與肝纖維化進(jìn)展密切相關(guān)的經(jīng)典信號通路Wnt/β-Catenin的主要相關(guān)蛋白。Wnt信號通路在HSC的激活和肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。Wnt1是肝損傷后激活的細(xì)胞因子，可導(dǎo)致β-Catenin大量聚集，促進(jìn)HSC的活化[14]。β-Catenin的活性可以促進(jìn)肝臟修復(fù)反應(yīng)和疾病的發(fā)展，β-Catenin的表達(dá)水平越高，肝纖維化程度越高，沉默β-Catenin可以抑制膠原的分泌和HSC的增殖，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。大量游離的β-Catenin到細(xì)胞核后能促進(jìn)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，并激活細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1。Cyclin D1對細(xì)胞周期的正調(diào)控會加速活化HSC的增殖，當(dāng)Cyclin D1表達(dá)被抑制時HSC的增殖也受到抑制，發(fā)生凋亡[16]。臨床常通過血液學(xué)指標(biāo)聯(lián)合病理學(xué)診斷(HE染色、Masson染色)確定肝纖維化。血液學(xué)指標(biāo)分為直接型指標(biāo)和間接型指標(biāo)，直接指標(biāo)HYP作為膠原組織的主要成分可以衡量體內(nèi)膠原含量，反映纖維化程度。間接指標(biāo)如ALT、AST可反映肝實質(zhì)損害指標(biāo)水平，與肝臟合成功能指標(biāo)總蛋白、Alb和Glo協(xié)同參照，可作為評價肝功能和纖維化水平的間接評價指標(biāo)[1]。

本研究采用水飛薊賓葡甲胺和不同劑量的舒肝和絡(luò)醒脾方對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，舒肝和絡(luò)醒脾方和水飛薊賓葡甲胺能夠發(fā)揮顯著的抗肝纖維化治療作用。其中，舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量能夠明顯改善大鼠的生理狀況、肝功能、肝臟的膠原蛋白分解代謝水平和肝組織病理改變及纖維化程度，且與水飛薊賓葡甲胺基本等效，治療效果優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量。在調(diào)控信號通路Wnt/β-Catenin主要蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平和蛋白表達(dá)方面，舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量對于關(guān)鍵蛋白 β-Catenin調(diào)控作用明顯優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量，且與水飛薊賓葡甲胺基本等效。上述結(jié)果提示，舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化作用可能與抑制Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白活化有關(guān)，且以舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量效果最為明顯，與戴琦等[17]益氣活血利水湯抑制慢性肝纖維化的研究結(jié)果較為一致。上述結(jié)果也提示，肝纖維化發(fā)病的分子機(jī)制和Wnt/β-Catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制均符合“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的學(xué)術(shù)思想，驗證了學(xué)說的科學(xué)性和有效性。

本研究的創(chuàng)新之處在基于“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說，把握肝纖維化絡(luò)脈瘀滯、肝郁脾困，氣血失和，進(jìn)而形成微小癥積的病機(jī)和證候要素，遵循扶正祛邪的總則，以舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血立法，創(chuàng)立舒肝和絡(luò)醒脾方，在基礎(chǔ)及臨床研究中均證實本方能有效發(fā)揮抗肝纖維化治療作用，印證了“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性和有效性。應(yīng)用中醫(yī)藥復(fù)方干預(yù)肝絡(luò)微小癥積的發(fā)展，亦體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“治未病”的思想。本實驗雖然從生理學(xué)、病理學(xué)和血液學(xué)方面驗證了舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化治療作用，并初步了解其抗纖維化機(jī)制可能是通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮作用，但由于復(fù)方中藥成分的復(fù)雜性，是否有其他信號通路參與仍需進(jìn)一步驗證，且舒肝和絡(luò)醒脾方對于脾臟血液動力學(xué)及免疫功能是否具有調(diào)控作用仍需進(jìn)一步探索。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年3月8日經(jīng)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，批號：2019-140，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王奎淞負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；魏書瑤、殷世鵬、李婕妠、陳世玉、郭嘉琪參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙鯤鵬、張秋菊負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。