嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞免疫療法在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用

李康偉， 尉 丁， 張若涵， 李 霄， 陶開山

1 第四軍醫(yī)大學(xué) a.研究生院， b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室， 西安 710032；2 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 肝膽胰脾外科， 西安 710032

原發(fā)性肝癌根據(jù)病理分型可劃分為肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌以及混合型肝癌。其中HCC約占原發(fā)性肝癌的90%[1]，已經(jīng)成為全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因[2]。在我國(guó)，肝炎相關(guān)肝硬化是HCC常見的發(fā)病原因，且大多數(shù)患者在就診時(shí)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，此時(shí)患者無法滿足手術(shù)治療指征，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)。

大部分HCC患者需要接受綜合性治療，如手術(shù)切除、微波消融、肝動(dòng)脈灌注化療栓塞術(shù)、放療、化療和腫瘤靶向藥物治療。肝移植僅限用于少部分患者，且肝源短缺。目前，外科手術(shù)仍是可切除肝癌最優(yōu)先的治療方案，然而肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者高達(dá)70%～80%[4]，其他常規(guī)治療策略往往不能達(dá)到令人滿意的療效。聯(lián)合索拉非尼、瑞戈非尼行靶向治療，部分患者也僅能增加短短數(shù)月的總生存期[5]。因此，迫切需要新的、有效的治療方案應(yīng)用于HCC治療。隨著免疫治療的發(fā)展，目前較具有研究前景的是嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)免疫療法。

1 CAR-T免疫療法概述

腫瘤免疫治療領(lǐng)域在過去的幾十年中取得了飛速的進(jìn)步，腫瘤免疫治療主要包括單克隆抗體、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、細(xì)胞疫苗和過繼性T淋巴細(xì)胞療法等[6]。CAR-T為過繼性T淋巴細(xì)胞療法之一，是一種頗具研究潛力且已經(jīng)取得臨床突破的免疫療法，其基本原理是將患者的T淋巴細(xì)胞通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)獲得能夠識(shí)別特定抗原的特異性T淋巴細(xì)胞，再重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，與腫瘤相關(guān)表面抗原結(jié)合，并激活免疫反應(yīng)從而破壞腫瘤細(xì)胞[7]。

CAR-T免疫療法融合了抗體對(duì)抗原的高特異性與T淋巴細(xì)胞殺傷靶腫瘤的細(xì)胞毒性這兩種優(yōu)點(diǎn)[8]。其基本構(gòu)造分為3個(gè)部分：胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。CAR-T免疫療法至今已發(fā)展到第五代。第1代因其在體內(nèi)增殖，能力較差，抗腫瘤能力存在很大的局限性。隨后研究人員在胞內(nèi)段引入?yún)f(xié)同共刺激分子增加CAR-T的抗腫瘤效果，加入1個(gè)共刺激分子稱為第2代。第3代加入2個(gè)協(xié)同共刺激分子，顯著提升CAR-T的抗腫瘤作用。第4代增加了新的細(xì)胞因子序列，使CAR-T能夠在病灶區(qū)域分泌增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子[9]。第5代CAR-T在此基礎(chǔ)上增加了細(xì)胞因子受體的胞內(nèi)段序列，被用來誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖，作用更加持久[10]。CAR-T識(shí)別特定抗原信號(hào)后激活并殺傷腫瘤細(xì)胞，激活后CAR-T可在體內(nèi)復(fù)制增殖以產(chǎn)生較為持久的療效，并釋放具有趨化作用的細(xì)胞因子引起其他免疫細(xì)胞聚集共同殺傷腫瘤細(xì)胞。2017年10月，全球首個(gè)CD19 CAR-T正式批準(zhǔn)應(yīng)用于治療成人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，臨床研究[11]結(jié)果顯示，接受治療12個(gè)月后，疾病無復(fù)發(fā)率為64%，存活率達(dá)到79%。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得較好療效的同時(shí)，實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)也在陸續(xù)開展。

2 CAR-T免疫療法在原發(fā)性肝癌治療中的應(yīng)用

目前，臨床試驗(yàn)[12]數(shù)據(jù)已證實(shí)CAR-T免疫療法具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。CAR-T可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而裂解的腫瘤細(xì)胞碎片與腫瘤相關(guān)抗原可發(fā)揮免疫激活劑的作用正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。由于同時(shí)具有細(xì)胞免疫和體液免疫的優(yōu)點(diǎn)，CAR-T可能成為原發(fā)性肝癌治療的一種有效手段[13]。在我國(guó)，CAR-T免疫療法逐漸成為臨床研究熱點(diǎn)。2017年，我國(guó)超過美國(guó)成為CAR-T免疫療法臨床試驗(yàn)數(shù)量第一的國(guó)家[14]。根據(jù)ClinicalTrial.gov數(shù)據(jù)，截至2021年底，全球肝癌CAR-T研究項(xiàng)目48項(xiàng)，我國(guó)有32項(xiàng)(67%)。

Wang等[15]開展的一項(xiàng)CD133-CAR-T研究，共入組23例晚期惡性腫瘤受試者，包括HCC受試者14例，其中2例腫瘤低負(fù)荷(腫瘤直徑<5 cm)的HCC受試者獲得了最長(zhǎng)的疾病穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間，分別為13.7個(gè)月和15.2個(gè)月；HCC受試者的中位無進(jìn)展生存期為7個(gè)月；3個(gè)月疾病控制率為64%，6個(gè)月疾病控制率為43%。另一項(xiàng)靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)CAR-T治療HCC的 Ⅰ 期臨床試驗(yàn)[16]結(jié)果顯示：患者6、24和36個(gè)月的總生存率分別為50.3%、42.0%和10.5%。本研究中心開展的一項(xiàng)CD147-CAR-T的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，最低劑量組(8×106個(gè)CAR-T細(xì)胞)的3例患者治療后腫瘤病灶縮小，腫瘤標(biāo)志物水平下降，較高劑量組(24×106個(gè)CAR-T細(xì)胞)目前仍在進(jìn)行觀察，期待獲得更好的療效。國(guó)際上其他針對(duì)HCC的CAR-T臨床試驗(yàn)也取得了一些成果，但仍面臨部分需要解決的問題[17]。

3 CAR-T免疫療法在原發(fā)性肝癌治療中面臨的困難與問題

CAR-T免疫療法在實(shí)體瘤治療中主要未解決的難點(diǎn)在于腫瘤部位浸潤(rùn)不良和T淋巴細(xì)胞抑制[18]，通過趨化因子受體改善T淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸是提高CAR-T發(fā)揮作用的可靠方法[19]，解決腫瘤部位浸潤(rùn)不良和T淋巴細(xì)胞抑制是CAR-T治療實(shí)體瘤獲得成功的突破口。

3.1 缺乏腫瘤特異性抗原 靶抗原的選擇是CAR-T免疫療法應(yīng)用于原發(fā)性肝癌治療首先面臨的難題，腫瘤靶抗原應(yīng)在腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)，而在身體重要器官不表達(dá)，減少對(duì)人體正常組織產(chǎn)生的毒副作用。AFP、CEA、GPC-3、MUC-1、CD133、CD147等通常在HCC中過度表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)水平很低，是潛在的治療靶點(diǎn)[20-22]。其中，CD147也被稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑，是一種高表達(dá)于癌細(xì)胞的跨膜糖蛋白，在原發(fā)性肝癌患者中陽(yáng)性率高達(dá)80%，與肝癌細(xì)胞的集體侵襲有關(guān)[23]，并且與患者總生存率呈負(fù)相關(guān)[24]，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。一般情況下，表達(dá)高水平靶抗原的腫瘤細(xì)胞會(huì)被CAR-T優(yōu)先清除，而表達(dá)靶抗原水平較高的正常組織細(xì)胞亦會(huì)受到攻擊。為減少對(duì)正常組織的損傷，特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，Chen等[25]報(bào)道了一種針對(duì)HCC靶向雙抗原的CAR-T，只有同時(shí)表達(dá)GPC-3和ASGR1(一種肝組織特異性蛋白)2種抗原的腫瘤細(xì)胞才可以被識(shí)別，進(jìn)而激活CAR-T殺傷腫瘤細(xì)胞。這些靶向雙抗原的CAR-T不會(huì)識(shí)別單獨(dú)表達(dá)單一抗原的正常組織，從而使殺傷作用更加精確，降低了因誤傷人體正常組織引起不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，但這可能導(dǎo)致表達(dá)單一靶向抗原的腫瘤細(xì)胞逃逸。Tang等[26]使用溶瘤病毒將腫瘤靶點(diǎn)特異性導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使靶抗原陰性的腫瘤細(xì)胞表達(dá)靶抗原，減少腫瘤細(xì)胞的逃逸現(xiàn)象。另一方面，溶瘤病毒對(duì)癌細(xì)胞的直接裂解作用導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原釋放，CAR-T和溶瘤病毒的結(jié)合可以增加CAR-T運(yùn)輸，提高抗腫瘤作用以及消除抗原陰性腫瘤細(xì)胞。

3.2 CAR-T對(duì)腫瘤組織的浸潤(rùn)性差 CAR-T向腫瘤中浸潤(rùn)和駐留在實(shí)體瘤中起著重要的作用，但腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和異常的血管形成了致密的物理屏障，這種物理屏障和肝臟免疫抑制環(huán)境導(dǎo)致CAR-T較難滲入腫瘤組織[27]。Adachi等[28]研究認(rèn)為，部分趨化因子(IL-7等)可以顯著促進(jìn)CAR-T浸潤(rùn)到腫瘤組織，也可以通過腫瘤動(dòng)脈局部給藥的方式增加CAR-T在腫瘤組織中的駐留，能夠獲得比靜脈給藥更好的抗腫瘤效果。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中是浸潤(rùn)率最高的免疫細(xì)胞，Chen等[29]試圖利用CAR修飾的巨噬細(xì)胞對(duì)抗實(shí)體瘤，然而巨噬細(xì)胞難以在體內(nèi)增殖，療效有限。另外有學(xué)者[30]設(shè)想設(shè)計(jì)一種可同時(shí)殺傷成纖維細(xì)胞的CAR-T，降解纖維結(jié)締組織，以促進(jìn)CAR-T浸潤(rùn)。

3.3 腫瘤微環(huán)境抑制CAR-T活性 與其他實(shí)體腫瘤一樣，CAR-T在肝癌組織中的生長(zhǎng)增殖遠(yuǎn)不及血液系統(tǒng)腫瘤。原發(fā)性肝癌腫瘤組織由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成(成纖維細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等)，伴隨迂曲畸形的血管和致密的纖維結(jié)締組織，細(xì)胞過度的有氧酵解和血液灌注不良造成腫瘤微環(huán)境的基本特點(diǎn)是缺氧和低pH值[31]。Meng等[32]證實(shí)酸性條件可以通過上調(diào)HCC組織中受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1的表達(dá)，顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的遷徙，而碳酸氫鈉治療可以改善腫瘤組織的低pH值，從而減少腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，我國(guó)HCC往往建立在慢性炎癥的基礎(chǔ)之上，患者由肝炎進(jìn)展為肝硬化再轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟虼四[瘤和潛在的慢性肝臟炎癥共同塑造了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。此外，肝腫瘤中存在的免疫抑制細(xì)胞(如功能失調(diào)的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞)抑制T淋巴細(xì)胞增殖和自然殺傷細(xì)胞活性，保護(hù)腫瘤逃避免疫攻擊。肝腫瘤通過腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制逃避免疫反應(yīng)[33-34]，在肝腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中占重要地位，并且與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。在這種微環(huán)境中，CAR-T存活困難，難以達(dá)到理想的殺傷腫瘤效果。改善低氧、低pH的腫瘤微環(huán)境并聯(lián)合使用抗病毒藥物可有效提高CAR-T殺傷腫瘤的療效。

4 CAR-T免疫療法的安全性

CAR-T免疫療法相關(guān)的2種最常見的不良反應(yīng)為細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS)和神經(jīng)毒性綜合征(neurotoxicity syndrome,NT)。

CRS是由CAR-T釋放大量細(xì)胞因子(IFNγ、IL等)和趨化因子(CCL2、CXCL8等)而引起的炎癥反應(yīng)[35]。輸注CAR-T后，T淋巴細(xì)胞迅速擴(kuò)增，從而產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞激活相關(guān)的炎癥狀態(tài)，隨后多種細(xì)胞因子水平升高(IL-6、IFNγ等)，導(dǎo)致內(nèi)皮激活、血管內(nèi)凝血、血腦屏障通透性增加以及腦膜炎癥[36]。CRS表現(xiàn)為全身癥狀，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、全身疼痛，可迅速進(jìn)展為呼吸急促、缺氧、低血壓、心率加快、毛細(xì)血管滲漏、休克，其首發(fā)癥狀通常為發(fā)熱[37]。對(duì)于發(fā)熱等非特異性全身癥狀，主要是對(duì)癥支持治療，即應(yīng)用退熱藥和補(bǔ)液。Hariri等[38]認(rèn)為白蛋白對(duì)CRS患者更有效，因?yàn)槠淇梢越档兔?xì)血管滲漏和肺水腫的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于嚴(yán)重的CRS(以發(fā)熱、缺氧和升壓藥維持血壓為特征)，通常采用托珠單抗注射液(一種抗IL-6抗體)進(jìn)行治療。

CRS的治療和管理已逐步完善，但對(duì)NT的研究和治療仍在探索中。Mackall等[39]研究發(fā)現(xiàn)，由炎癥和細(xì)胞因子增加引起的血腦屏障破壞是NT發(fā)生的關(guān)鍵啟動(dòng)因素。NT可能表現(xiàn)為譫妄、腦病、失語(yǔ)、嗜睡、注意力不集中、激動(dòng)、震顫、癲癇發(fā)作，以及罕見的腦水腫[40]，嚴(yán)重CRS和NT風(fēng)險(xiǎn)增加的患者建議應(yīng)用大劑量皮質(zhì)類固醇(地塞米松、甲潑尼龍)治療[41]。上述2種常見的不良反應(yīng)在給予對(duì)癥支持治療后可緩解，僅少數(shù)患者會(huì)發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[42]，臨床中發(fā)現(xiàn)，相較于血液系統(tǒng)腫瘤的CAR-T治療，實(shí)體瘤CAR-T治療的不良反應(yīng)發(fā)生率相對(duì)較低，為實(shí)體瘤CAR-T臨床試驗(yàn)的順利開展提供了保障。

5 小結(jié)與展望

CAR-T免疫療法對(duì)肝癌等實(shí)體惡性腫瘤的治療尚處于大量臨床試驗(yàn)階段，目前已經(jīng)取得了一定的成果。缺乏特異性抗原靶點(diǎn)、腫瘤微環(huán)境抑制、CAR-T在肝癌組織中浸潤(rùn)性差是CAR-T免疫療法應(yīng)用于肝癌治療的主要障礙。此外，其安全性以及副作用也是需要關(guān)注的問題，但各種實(shí)體腫瘤的第一階段數(shù)據(jù)表明，CAR-T治療較為安全，毒副作用可控。相信隨著CAR-T免疫療法的不斷改進(jìn)和完善，將取得更好的療效。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李康偉起草并撰寫文章主要內(nèi)容；尉丁負(fù)責(zé)協(xié)助補(bǔ)充文獻(xiàn)并完善文章內(nèi)容；張若涵負(fù)責(zé)主要內(nèi)容修改；李霄協(xié)助文章修改及審校；陶開山指導(dǎo)文章思路并修改了文章關(guān)鍵內(nèi)容。