基因編輯豬用于急性肝衰竭治療的路徑探討

淮國(guó)麗， 杜嘉祥， 潘登科

1 電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院， 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院， 臨床免疫轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610072；2 成都中科奧格生物科技有限公司， 成都 610094

對(duì)于肝細(xì)胞癌或急性肝病等終末期肝病患者，肝移植是唯一的治療方式，但是供體的極度短缺嚴(yán)重影響了等待移植者生命的延續(xù)。近五年來(lái)，我國(guó)器官捐獻(xiàn)率有所上升，但是供肝和移植需求的比例仍嚴(yán)重失衡。2020年，我國(guó)共有17 897例患者接受移植，但是僅占等待移植患者的5%左右，這意味著有近95%的患者可能因?yàn)榈却陂g病情惡化等因素錯(cuò)過(guò)移植機(jī)會(huì)或者被移出等待名單[1-2]。利用豬來(lái)源的供體肝和肝細(xì)胞被認(rèn)為是潛在的解決器官緊缺問(wèn)題的有效方案。1968年，Calne 等[3]首次嘗試野生型豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植實(shí)驗(yàn)，術(shù)后6～30 h內(nèi)，7只狒狒中有4只死于大量出血，考慮其主要的死亡原因是超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection，HAR)。α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-galactosy transferase，GGTA1)的敲除(GTKO)使HAR問(wèn)題基本被解決，但是移植物仍無(wú)法長(zhǎng)期存活[4]。目前，研究者認(rèn)為影響異種肝移植存活率的主要原因包括：移植物血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)，持續(xù)性血小板減少癥和全身性消耗性凝血功能障礙，且伴隨的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)影響細(xì)胞肝移植物的長(zhǎng)期生存[5]。此外，由于肝臟是一個(gè)具備合成功能的特殊器官，供體與受體的不相容性也會(huì)影響移植物的存活，因此，探索適用于異種肝移植的人源化肝臟也是解決異種肝移植問(wèn)題的一個(gè)思路。根據(jù)影響異種肝移植術(shù)后影響移植物存活的因素，本文將從基因編輯豬和嵌合體2個(gè)角度進(jìn)行綜述，并展望基因編輯豬和嵌合體豬在未來(lái)異種肝移植的臨床應(yīng)用。

1 應(yīng)對(duì)固有免疫的基因改造

1.1 HAR 從1968年Calne 等實(shí)施第1例野生型(WT)豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植后的20年內(nèi)，一些研究團(tuán)隊(duì)完成了幾十例WT豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植實(shí)驗(yàn)。然而，受體的存活時(shí)間從未超過(guò)3 d，移植后均發(fā)生HAR，并且發(fā)現(xiàn)受體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及IgM、IgG和C3的沉積，受體的血管有血栓形成和出血性壞死等現(xiàn)象，由此推斷野生型豬作為供體很可能會(huì)造成移植失敗[3,6-8]。在2000年，Ramirez等[9]實(shí)施了第1例以表達(dá)衰減加速因子(CD55)的轉(zhuǎn)基因豬為供體，對(duì)狒狒進(jìn)行原位異種肝移植，狒狒存活8 d并且肝移植物未表現(xiàn)出HAR的病理學(xué)特征，提示CD55可顯著限制補(bǔ)體活化并有效控制HAR強(qiáng)度。2005年，該團(tuán)隊(duì)在供體豬內(nèi)又轉(zhuǎn)入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白-MAC抑制蛋白(CD59)和α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(H-transferase)，將CD55/CD59/H-transferase供體肝移植至狒狒體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)供肝未出現(xiàn)明顯的HAR且肝臟結(jié)構(gòu)完整，但存活時(shí)間僅延長(zhǎng)了13～24 h。以上基因編輯豬雖然對(duì)HAR有所改善，但并未實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間[10]。隨后，大量研究發(fā)現(xiàn)供體豬的特異性抗原包括α-Gal才是導(dǎo)致HAR的主要因素。2010年，Esker等[11]首次使用α-Gal敲除(GTKO)且表達(dá)人膜輔因子蛋白(CD46)的小型豬作為供體開(kāi)展異種肝移植，受體術(shù)后雖然出現(xiàn)了嚴(yán)重的血小板減少癥，但肝功能正常，且生存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d。

以上敲除GGTA1可有效改善HAR的發(fā)生，移植物的生存時(shí)間仍未明顯改善，有研究團(tuán)隊(duì)嘗試獲得包括α-Gal抗原以內(nèi)的抗原雙敲或者三敲豬來(lái)作為供體來(lái)改善豬和人的不相容性。Butler等[12]通過(guò)體外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)聯(lián)合GGTA1敲除即GGTA1-/-CMAH-/-豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)比GGTA1-/-與人血小板結(jié)合更少，提示抗原雙敲除比單敲除更能抑制體液免疫反應(yīng)。此外， Cimeno等[13]利用體外灌注模型研究發(fā)現(xiàn)基因型為GTKO/hCD46/Neu5GcKO的豬肝，相較于GTKO/hCD46基因型而言，白蛋白表達(dá)水平更高，提示Neu5GcKO表型可降低抗原特異性，對(duì)移植物具有保護(hù)作用。盡管如此，有學(xué)者[14]認(rèn)為GTKO和CMAHKO 雙敲豬仍不足以實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物的存活率。此后，Li等[15]利用CRISPE/CAS9技術(shù)敲除了永生化豬內(nèi)皮細(xì)胞中4個(gè)主要異種抗原GTKO、CMAH、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(B4GALNT)和SLA-Ⅰ，在體外觀察人對(duì)抗原敲除豬的特異性反應(yīng)，結(jié)果顯示，這4個(gè)抗原的敲除可以顯著降低豬細(xì)胞的抗原性，但是仍能激活人的自然殺傷細(xì)胞反應(yīng)。

綜上所述，通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)供體豬GGTA1、CMAH、β4galNT2和SLA-Ⅰ進(jìn)行抗原雙敲除乃至多敲除可以降低異種肝移植的異種特異性反應(yīng)，但若聯(lián)合人體調(diào)節(jié)補(bǔ)體蛋白的轉(zhuǎn)入包括CD46，CD55和CD59，異種肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)等引起的肝移植物損失可能會(huì)大有改善。但異種肝移植后的血小板減少癥等問(wèn)題還需要通過(guò)其他相關(guān)基因的編輯來(lái)緩解，由此才能更進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物生存時(shí)間的期望。

1.2 血小板減少癥 目前，豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植試驗(yàn)結(jié)果表明，異種肝移植術(shù)后的受體會(huì)很快出現(xiàn)移植物TMA，持續(xù)性血小板減少癥和全身性耗竭性凝血功能障礙，而這些問(wèn)題也是影響異種肝移植存活時(shí)間的主要原因。所以，針對(duì)固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的血小板吞噬作用以及凝血相關(guān)蛋白激活的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等問(wèn)題，可以利用基因編輯技術(shù)對(duì)供體豬進(jìn)行改造，來(lái)改善異種肝移植術(shù)后移植物丟失問(wèn)題[1]。

在豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植中，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物血小板會(huì)被豬肝移植物識(shí)別為“外來(lái)物”，并被豬 Kupffer細(xì)胞和LSEC吞噬[16]。CD47是一種在所有組織中普遍表達(dá)的Ig超家族的整合素相關(guān)蛋白，其與巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α結(jié)合，將Src同源區(qū)2蛋白酪氨酸磷酸酶1募集到磷酸化的免疫受體酪氨酸相關(guān)的抑制性基序，印上能夠調(diào)節(jié)自我吞噬的抑制信號(hào)(“不要吃我信號(hào)”)，該信號(hào)可減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)理細(xì)胞吞噬作用[17]。潘登科團(tuán)隊(duì)[18]成功制備GTKO/hCD47巴馬小型豬，并驗(yàn)證了hCD47的轉(zhuǎn)入可以減弱異種移植中由受體巨噬細(xì)胞引起的排斥反應(yīng)。Zhang等[19]將GTKO/hCD7豬的肝臟移植到藏酋猴中，發(fā)現(xiàn)異位輔助移植后受者血流量穩(wěn)定，受體沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的凝血障礙或免疫排斥反應(yīng)。由此可知，將人CD47在豬內(nèi)皮細(xì)胞上的異位表達(dá)可以顯著減少人類巨噬細(xì)胞對(duì)異種細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用。此外，Paris等[20]發(fā)現(xiàn)異種肝移植在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)后會(huì)發(fā)生血小板減少癥，主要是由于豬LSEC識(shí)別并結(jié)合半乳糖b1-4N-乙?；咸烟前?Galb1,4-NacGlc)糖蛋白通過(guò)去唾液酸糖蛋白受體1(recombinant asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)介導(dǎo)發(fā)生結(jié)合和吞噬血小板，通過(guò)去唾液酸糖蛋白處理消除這種糖蛋白可降低血小板的吞噬作用。2015年，該團(tuán)隊(duì)使用TALEN技術(shù)敲除供體豬的ASGR1基因，結(jié)果顯示ASGR1-/-豬肝臟在灌注期間吞噬的人血小板數(shù)少于家豬肝臟，說(shuō)明供體豬ASGRI基因敲除可減少豬-人異種移植中血小板的吞噬，這對(duì)于異種肝移植中移植物的存活至關(guān)重要[21]。2016年，潘登科團(tuán)隊(duì)[22]成功制備出GTKO/ASGR1KO五指山小型豬，為解決異種肝移植后的血小板減少癥這一問(wèn)題提供了良好的基礎(chǔ)材料。

除了排除固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，還可以改造與凝血功能有關(guān)的基因位點(diǎn)來(lái)改善異種肝移植后的凝血功能障礙等問(wèn)題。組織因子(tissue factor，TF)是異種肝移植誘導(dǎo)的耗竭性凝血病的主要驅(qū)動(dòng)因素，而TF途徑抑制因子(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)可抑制TF活性。Ahrens等[23]研究證實(shí)，與WT豬相比，TF的siRNA敲低豬的凝血時(shí)間顯著增加，血栓形成減少。據(jù)報(bào)道[24]，竇科峰院士團(tuán)隊(duì)指出表達(dá)人TFPI的豬在臨床前試驗(yàn)中已經(jīng)出現(xiàn)了令人期待的結(jié)果。Pen等[25]體外檢測(cè)了原代細(xì)胞對(duì)狒狒或豬血小板的聚集能力，發(fā)現(xiàn)豬LSEC對(duì)狒狒小板的吞噬作用最為明顯，通過(guò)阻斷vWF和整合素黏附途徑可以阻止血發(fā)現(xiàn)小板聚集和吞噬作用。除此之外，向豬體內(nèi)轉(zhuǎn)入人血栓調(diào)節(jié)蛋白(human thrombomodulin，hTM)細(xì)胞可以在體外顯著增強(qiáng)人活化蛋白C的表達(dá)[25]，但是來(lái)自hTM轉(zhuǎn)基因豬的器官在肝臟中的表達(dá)最低，需要進(jìn)一步優(yōu)化豬肝臟中的hTM表達(dá)來(lái)評(píng)估這個(gè)基因改造對(duì)肝異種移植的作用[26]。此外，多項(xiàng)研究表明還可以通過(guò)表達(dá)人類抗血栓或抗凝基因例如CD39[27]、內(nèi)皮蛋白C受體(hEPCR)[28]來(lái)減輕凝血級(jí)聯(lián)激活引起的凝血功能障礙，提高異種移植的存活率。

通過(guò)對(duì)供體豬進(jìn)行特定分子的改造可以減輕異種肝移植術(shù)后面臨的急性排斥反應(yīng)以及血小板減少癥和TMA等凝血功能障礙等問(wèn)題。為了改善豬移植物和人類免疫系統(tǒng)之間的免疫和生理分子不相容性，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，可以通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合多種豬特異性抗原表位敲除、敲入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和凝血調(diào)節(jié)相關(guān)因子蛋白來(lái)開(kāi)發(fā)基因工程豬[29]。2020年，竇科峰院士團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了13基因改良豬到恒河猴的異種肝移植試驗(yàn)，供體豬基因型為PERV-KO/GalT-KO/b4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hb2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)，移植物術(shù)后存活26 d，該研究驗(yàn)證了13基因豬可以抑制異種移植排斥和受體凝血異常，但此9基因的摻入并未完全避免異位輔助肝移植對(duì)異種移植物的損害[24]。此外，Cimeno等[13]通過(guò)體外灌注模型發(fā)現(xiàn) ，GalTKO/hCD46/Neu5GcKO比GTKO/hCD46/hCD55/hEPCR/hTFPI/hCD47的豬肝的白蛋白表達(dá)水平更高。上述研究提示，雖然選擇聯(lián)合多種基因組合可以改善移植物的存活，但是基因組合并不一定是越多越好。因此，篩選較優(yōu)的基因型組合非常重要。此外，Shah等[30]利用無(wú)pCMV的GTKO豬作為供體，并給予外源性人體凝血因子和共刺激阻滯劑調(diào)整抑制劑方案，術(shù)后受體未出現(xiàn)排斥、炎癥或TMA，且實(shí)現(xiàn)了移植物存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)29 d，這無(wú)疑為未來(lái)加速肝移植走向臨床應(yīng)用提供了一個(gè)有效的治療思路。

2 人源化肝臟嵌合體豬

免疫排斥是異種移植中現(xiàn)存的主要障礙，但這主要針對(duì)功能性單一的器官，如本身承載較少的代謝和分泌的心臟、腎臟等[31]。而對(duì)于具有復(fù)雜性功能的器官，如肝臟、肺臟等，為實(shí)現(xiàn)移植物的長(zhǎng)期存活，除了解決免疫排斥問(wèn)題外還需對(duì)其他功能性基因進(jìn)行人源化改造。目前的基因工程技術(shù)雖已取得一些突破性進(jìn)展，但一次性定向改造所有基因仍是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的研究工作。目前，在豬體內(nèi)培育人源化器官是一種較為可行的解決方案。

根據(jù)目前的研究，已經(jīng)可以制備物種相近的嵌合體動(dòng)物。2010年，美國(guó)和日本的研究團(tuán)隊(duì)[32-33]完成了大小鼠嵌合個(gè)體的制備，并成功在小鼠體內(nèi)培育出大鼠的胰腺。但目前可成功培育物種差異大的嵌合個(gè)體較少。2017年，美國(guó)研究團(tuán)隊(duì)[34]開(kāi)展了豬人嵌合體胚胎實(shí)驗(yàn)，觀察時(shí)間為3～4周，結(jié)果表明人細(xì)胞占比約為1/100 000。2019年，我國(guó)研究團(tuán)隊(duì)[35]成功制備了2只豬猴嵌合體，新個(gè)體中嵌合的藏酋猴細(xì)胞比例為1/10 000～1/1000，雖然該比例仍很低，但這標(biāo)志著嵌合體研究的巨大進(jìn)步。即便異種嵌合體研究的目的是服務(wù)于人，且可以解決器官資源短缺問(wèn)題，但仍會(huì)受到倫理道德的約束。例如在歐美部分國(guó)家，人體器官的嵌合體研究是被允許的，但在人與動(dòng)物的嵌合體中，人細(xì)胞不能進(jìn)入到動(dòng)物的生殖系統(tǒng)和大腦中[36]。為了避免以上問(wèn)題，可通過(guò)影像學(xué)結(jié)合手術(shù)的方式，對(duì)胚胎期仔豬的肝臟部位定向注射人源干細(xì)胞，由于人源干細(xì)胞提前轉(zhuǎn)入了條件性自殺性基因，在進(jìn)入其他組織時(shí)人源干細(xì)胞將會(huì)啟動(dòng)自殺程序，可以防止在非肝臟部位形成嵌合體[37]。

目前，嵌合體發(fā)育遇到的主要障礙是不同物種細(xì)胞間不能很好地形成免疫耐受，這一問(wèn)題可通過(guò)培育免疫缺陷動(dòng)物來(lái)提高嵌合比例。白介素受體亞基γ(interleukin 2 receptor subunit gamma，IL2RG)、重組激活基因(Recombination activating gene，Rag)1和Rag2是激活特異性免疫的關(guān)鍵基因，敲除后個(gè)體表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞缺失且缺乏補(bǔ)體活性，通過(guò)這種方式可以獲得一種重度免疫缺陷個(gè)體[38-39]。由于免疫缺陷動(dòng)物的培育還需要在無(wú)菌環(huán)境下結(jié)合剖腹產(chǎn)手術(shù)完成，特別是臨床級(jí)別的醫(yī)用供體豬制備，所以此手術(shù)需在無(wú)指定病原體(designated pathogen free，DPF)超潔凈級(jí)設(shè)施內(nèi)開(kāi)展。此外，對(duì)肝臟先天性損傷的豬胚胎進(jìn)行人干細(xì)胞嵌合，能夠在豬體內(nèi)制備人源化肝臟。延胡索酸乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH)的缺失將導(dǎo)致肝細(xì)胞中酪氨酸的毒性代謝產(chǎn)物無(wú)法正常代謝，持續(xù)性積累會(huì)引發(fā)肝損傷，造成Ⅰ型遺傳性酪氨酸血癥[40-41]。但在沒(méi)有干預(yù)措施下，F(xiàn)AH基因敲除豬在妊娠期間即會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，因此需要依賴特定的藥物才能保證出生和存活。

綜上所述，利用基因編輯技術(shù)在無(wú)菌環(huán)境下制備的GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可以作為直接培育人源化器官的來(lái)源，這種方式也是解決異種肝臟移植物不能長(zhǎng)期存活的一種可行方案。然而，培育人源化肝臟嵌合體豬是異種肝移植的技術(shù)高地，存在嵌合細(xì)胞占比低等問(wèn)題。并且，該培育方式尚存較多技術(shù)難點(diǎn)，包括基因編輯技術(shù)、克隆技術(shù)和胚胎定向注射干細(xì)胞技術(shù)等均存在較大的挑戰(zhàn)。此外，F(xiàn)AH敲除豬的藥物維持劑量、剖腹產(chǎn)仔豬的人工培養(yǎng)方案等還需要進(jìn)行深入研究，加之DPF凈化設(shè)施的必要性，使整體研究投入較大且實(shí)驗(yàn)存在較多的不確定性。以上技術(shù)難點(diǎn)及其他各方面問(wèn)題均制約了該方案的開(kāi)展。但相信隨著異種腎臟、心臟的移植逐步進(jìn)入臨床研究階段并取得一定成果，將有更多的研究者致力于異種肝臟移植研究，人源化肝臟嵌合體豬也將成功培育。

3 小結(jié)與展望

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，可以通過(guò)對(duì)供體豬進(jìn)行基因改造和利用人源化細(xì)胞獲得肝臟嵌合體來(lái)解決異種肝移植后的免疫排斥及生理功能不匹配的雙重問(wèn)題。首先，對(duì)于未來(lái)用于異種肝移植供體豬的基因型組合，筆者認(rèn)為α-Gal，Neu5Gc對(duì)于抑制急性排斥反應(yīng)是抗原敲除的必要選擇，CD47以及ASGR1是抑制異種肝移植術(shù)后血小板減少癥等的必需基因，對(duì)于人源補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白可以采取單個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)入。與此同時(shí)，最重要的是要補(bǔ)充人體凝血因子及共刺激阻斷劑等免疫抑制劑方案。通過(guò)以上方式不僅有希望大大改善異種肝移植的排斥反應(yīng)，且可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，使得基因編輯豬可以更好地發(fā)揮“橋接過(guò)渡”的作用。其次，在無(wú)菌環(huán)境下利用基因編輯技術(shù)制備GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可作為直接培育人源化器官的來(lái)源，這種方式是解決移植物長(zhǎng)期存活問(wèn)題的另一途徑。雖然，目前培育人源化肝臟嵌合體豬面臨著嵌合細(xì)胞占比低，基因編輯及克隆技術(shù)等問(wèn)題。但隨著越來(lái)越多研究者的關(guān)注和研究，相信人源化肝臟嵌合體豬和理想的多基因編輯豬也將被成功培育，以突破異種肝移植目前存在的障礙，推動(dòng)異種肝移植向臨床應(yīng)用更靠近一步，為等待肝移植的患者和家庭帶來(lái)福音。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：淮國(guó)麗負(fù)責(zé)獻(xiàn)收集，撰寫論及修改；杜嘉祥參與基因編輯部分內(nèi)容的指導(dǎo)和修改；潘登科提供章思路，指導(dǎo)撰寫及修改。