阿爾茨海默病腦TAU蛋白磷酸化位點綜述

劉 碩綜述， 曹云鵬審校

阿爾茨海默氏病(AD)是癡呆中最典型的疾病，占所有癡呆病例的50%至60%[1]。AD的典型病理標(biāo)志是神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和細(xì)胞外的淀粉樣斑塊(SP)沉積[2]。1988年，克勞德·維希克從AD患者大腦的斑塊中分離出TAU，首次證明TAU可能是癡呆癥的病因[3]。

TAU是神經(jīng)元主要的微管相關(guān)蛋白，位于與微管相關(guān)的神經(jīng)元軸突，可促進(jìn)微管的組裝以及穩(wěn)定微管的結(jié)構(gòu)[4]。TAU由17號染色體單基因編碼，由于其前體基因的外顯子2、3、10的選擇性剪接，在成人大腦中表達(dá)為六種同工型，分別為2N4R(TAU441)、1N4R(TAU412)、0N4R(TAU383)、2N3R(TAU410)、1N3R(TAU381)和0N3R(TAU352)，人類胎兒的大腦僅表達(dá)0N3R亞型[5]。根據(jù)序列和功能特性，可將TAU分為四個區(qū)域：NTR(N末端區(qū)域)、PRR(富含脯氨酸區(qū)域)、MBR(微管結(jié)合區(qū)域)以及CTR(C末端區(qū)域)[6]。

TAU是一種磷蛋白，正常低水平的磷酸化才能使TAU發(fā)揮最佳功能，而高水平異常磷酸化的TAU則失去其生物學(xué)活性[7]。Herrmann等用ELISA測定快速尸解的AD與同年齡正常人的腦組織勻漿，表明 AD組的額葉皮層、頂葉皮層和海馬的TAU磷酸化水平明顯增加，其中海馬最高，但在小腦中未觀察到差異[8]。在正常的人腦中，每摩爾TAU含有2～3 mol磷酸鹽，且負(fù)面調(diào)節(jié)TAU與微管的結(jié)合，而在AD腦中，TAU被3～4倍過度磷酸化，每摩爾TAU含有8 mol磷酸鹽，磷酸化水平達(dá)到飽和[9]，并聚成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)[10]。NFT計數(shù)與TAU磷酸化水平正相關(guān)[8]。TAU的C末端區(qū)域的高水平磷酸化可能是其自聚集為NFT的原因[11]。NFT結(jié)構(gòu)中有大量異常的雙股螺旋纖維(PHF)，成束密集排列，富含超磷酸的TAU[12]。認(rèn)知障礙在經(jīng)典纏結(jié)形成之前發(fā)生，TAU過度磷酸化可能是AD認(rèn)知障礙的風(fēng)險機(jī)制[13]。

1 AD患者TAU磷酸化位點

在由441個氨基酸組成的最長的人類TAU亞型中，總共有85個可磷酸化位點，其中45個絲氨酸殘基，35個蘇氨酸殘基和5個酪氨酸殘基，分別占TAU可磷酸化殘基的53%、41%和6%[14]，5個酪氨酸殘基為Tyr18，Tyr29，Tyr197，Tyr310，Tyr394[15]。單個TAU分子不可能在所有這些位點都被磷酸化，PHF中 TAU至少在37個絲氨酸/蘇氨酸殘基位點及2個酪氨酸殘基位點磷酸化，包括：Thr-39、Ser-46、Thr-69、Thr-123、Ser-137、Thr-153、Thr-175、Thr-181、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-205、Ser-208、Ser-210、Thr-212、Ser-214、Thr-217、Thr-231、Ser-235、Ser-237、Ser-238、Ser241、Ser-262、Ser-285、Ser-305、Ser-324、Ser-352、Ser-356、Ser-396、Ser-400、Thr-403、Ser-404、Ser-409、Ser-411、Ser-412、Ser-413、Ser-416、Ser-422、Thr-427、Ser-433、Ser-435[7]以及Ser-68、Thr-71、Ser-113、Ser-184、Ser-185、Ser-191、Tyr-197、Ser-258、Tyr-394、Thr-427、Ser-433、Ser-435[16]。其中最主要的十個超磷酸化位點是Ser198，Ser199，Ser202，Thr231，Ser235，Ser396，Ser404，Ser409，Ser413和Ser422[17]，Ser404磷酸化程度最高[18]。在AD大腦中，TAU過度磷酸化會誘導(dǎo)惡性循環(huán)，促進(jìn)TAU病理在腦中的傳播以及在人腦脊液(CSF)中的積累[19]。Russell及Mitra等通過質(zhì)譜法對CSF中的磷酸化TAU分析表明，與正常人腦對照組相比，AD患者的CSF中一些位點磷酸化明顯增加(見表1)。但AD患者CSF Ser202磷酸化程度卻較正常人低[18]。

在AD早期磷酸化程度就升高的位點：Thr181，Ser199，Thr205和Ser404[20]Thr217，Ser262，Thr231、Ser396、Thr212[21，22]，其中TAU的Ser199殘基在AD發(fā)展的早期和晚期均異常過度磷酸化[23]，Thr231的磷酸化程度隨AD的發(fā)展而降低[24]。Ser202、Thr205、Ser409和Ser422磷酸化程度升高發(fā)生在NFT后期[25]。

異常高磷酸化的TAU可以隔離正常TAU與微管，進(jìn)一步破壞微管動力學(xué)，但需要多個位點同時磷酸化才能破壞TAU與微管之間的相互作用[26]。Thr212，Ser214，Thr231，Ser235和Ser262，是抑制TAU結(jié)合微管的主要位點，Ser262、Thr231、Ser 235處磷酸化大大降低了Tau與微管結(jié)合的能力分別降低了33%、26%和9%，導(dǎo)致微管不穩(wěn)定[27]；在AD神經(jīng)退行性變早期，Thr212，Thr231和Ser262這三個磷酸化升高位點的組合將TAU轉(zhuǎn)化為毒性分子，導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)的破壞和細(xì)胞死亡[22]；磷酸化的Thr231是對去磷酸化具有異常抵抗力的殘基[26]，磷酸化水平升高可預(yù)測輕度認(rèn)知障礙患者向AD轉(zhuǎn)化[28]；磷酸化Thr181是CSF中公認(rèn)的AD核心生物標(biāo)志物[29]；TAU在Ser396和Ser404處的磷酸化增加通過從微管中分離正常TAU分子而損害微管組裝，在體外產(chǎn)生更多的原纖維形式TAU，聚集增加[1]；Ser202、Thr205磷酸化增加使得TAU微管成核活性降低，微管解聚和不穩(wěn)定，同時與后來轉(zhuǎn)化為原絲和細(xì)絲有關(guān)[30]；Thr205的磷酸化可特異性抑制淀粉樣蛋白β(Aβ)的毒性，是具有保護(hù)作用而不是毒性促進(jìn)作用的唯一位點[31]；Ser199的磷酸化是AD中，脆弱的神經(jīng)元向神經(jīng)纖維變性失衡的關(guān)鍵步驟[23]。Yu等研究表明Thr181，Thr205，Thr217和Ser404磷酸化在大鼠胚胎期和出生后早期在神經(jīng)突生長中起關(guān)鍵作用，Ser202，Thr212，Ser356和Ser404的磷酸可能與神經(jīng)突生長無關(guān)[11]。所有這些位點的磷酸化也不是完全獨立的，如必須先磷酸化Ser235才能使Thr231磷酸化[26]；Ser214處的磷酸化顯著抑制了隨后在Thr212和Thr217處的磷酸化，；Ser409處的磷酸化抑制了隨后在Ser404處的磷酸化[32]。

2 正常成人TAU磷酸化位點

對人腦組織活檢的研究表明，正常人腦TAU在大多數(shù)與PHF-TAU相同的位點上以低計量水平被磷酸，病理上這些位點則磷酸化過度[7，33]。由于檢測方法的不同，所檢測到的正常人腦TAU的磷酸化位點也不同。這些位點包括活檢法檢測到位點：Thr-181、Ser-202、Ser-214、Thr-231、Ser-262、Ser-396、Ser-404、Ser-409[26，34～36]；質(zhì)譜法檢測到的位點：Thr-50、Thr-52、Thr-56、Ser61/Thr63/er64(至少兩個點)、Ser-68、Thr-69、Thr-71、Thr-76、Thr-101、Thr-102、Thr-111、Ser-113、Thr-123、Thr-175、Thr-181、Ser-184、Ser-185、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-212、Ser-214、Thr-217、Thr-231(不確定)、Ser-396、Ser-404、Ser-409、Ser-411、Ser-412、Ser-413(Ser411/Ser412/Ser413至少2個點)、Ser-416[37]；IIPSC法檢測到的位點：Thr-181、Ser-198、Ser-199、Ser202/Thr205、Thr-231、Ser-262、Ser-396、Ser400/、Thr403/、Ser404Ser-416[1，38]。一定水平的磷酸化是正常的，有助于神經(jīng)元維持其微管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞活性。Barthélemy R等用質(zhì)譜法檢測正常人CSF中TAU磷酸化位點，如表1所示，但是與AD患者相比，磷酸化水平較低。

表1 CSF中磷酸化位點

在人腦的天然TAU中，Ser422磷酸化程度非常弱或完全不被磷酸化[35]。也有其他研究方法顯示正常成年人大腦中TAU的Ser195、Ser198、Ser199、Thr212位點不會被磷酸化，Ser199位點在兒童及青年期被磷酸化，但隨著年齡的增長磷酸化水平降低[23]。

Thr172，Ser193，Thr222，Ser387和Ser395是大鼠腦TAU中磷酸化的正常位點[39]，正常大鼠TAU在Thr212，Thr217，Thr231，Ser396，Ser404，Ser422的磷酸化非常低，而在AD大鼠中的磷酸化增加到10到100倍[11]。

3 胎兒腦TAU磷酸化位點

與正常成人腦TAU相比，胎兒腦TAU磷酸化程度更高，但沒有明顯的毒性[28，34]。成年大腦整體TAU磷酸化水平的降低可能是由于磷酸酶水平的升高，以及激酶水平下調(diào)[11，23，39]。

TAU的表達(dá)和磷酸化水平均受發(fā)育調(diào)節(jié)。高磷酸化的TAU是發(fā)育過程中軸突發(fā)生所必需的，對微管可塑性具有必要性[36]。發(fā)育中大腦的TAU可能比成熟大腦的TAU具有更小的微管結(jié)合活性[11]。與成人腦TAU相比，胎兒腦TAU在與AD腦幾個相同的磷酸化位點上被高度磷酸化，如表2所示，但Ser 409位點高度磷酸化似乎是AD特有的[36]。

Hefti等在大鼠中也有相似發(fā)現(xiàn)，但與人腦不全相同，如表2所示。AD大鼠大腦Ser214位點的磷酸化水平低于或與胎兒大鼠大腦相似，但人胎兒大腦中Ser214位點的磷酸化程度比AD患者要強(qiáng)得多[38]。Ser262和Ser356，位于微管結(jié)合域內(nèi)，可以認(rèn)為Ser262和Ser356位點的磷酸化對發(fā)育大腦中TAU的生物學(xué)活性至關(guān)重要[11]。

表2 人與大鼠胎兒Tau磷酸化位點

盡管正常發(fā)育中的大腦和AD大腦的TAU都在多個位點被高度磷酸化，且在前者中發(fā)現(xiàn)了無毒的TAU聚集體[36]，但只有后者抑制了微管的組裝，并聚合成NFT[11]，正常胎兒大腦TAU的高度磷酸化不足以誘導(dǎo)神經(jīng)原纖維病理。

4 FAD與SAD的TAU磷酸化位點

大多數(shù)AD病例是散發(fā)性的，病因不明，稱為散發(fā)性阿爾茨海默氏病(SAD)，只有5%的AD患者表現(xiàn)出該病的家族性單基因形式，稱為家族性阿爾茨海默氏病(FAD)[40]。在FAD病例中，約有一半與早老素1(PS-1)基因突變有關(guān)，而早老素2(PS-2)和淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)基因突變代表較少[41]。FAD早期發(fā)病，迅速發(fā)展到終末期期[42]。有證據(jù)顯示PS-1突變加速NFT形成，這表明PS-1突變也可能影響TAU磷酸化[7]，但PS-1突變的多態(tài)性不影響與AD發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的最終神經(jīng)病理學(xué)，F(xiàn)AD和SAD之間的總病理負(fù)荷沒有差異[42]。

在FAD和SAD患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)系衍生的神經(jīng)元中比較TAU超磷酸化的研究顯示，Ser262、Ser396、Ser202 / Thr205、Thr181、Ser198、Ser199、Thr231、Ser400 / Thr403 / Ser404、Ser416位點磷酸化水平在FAD和SAD衍生的神經(jīng)元之間未觀察到主要差異[1，38]。

與年齡匹配的野生型同窩仔(WTs)相比，表達(dá)PS-1(L235P)的老年(21月半齡)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中，TAU在Ser396，Ser404，Thr231和Ser198 / 199/202表位的磷酸化顯著增加[43]。

5 尸檢與活檢

從活檢到尸檢，AD患者SP和NFT的密度以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化顯著增加[42]。尸檢的AD患者大腦TAU磷酸化水平降低，很大程度上歸因于磷酸酶的能量非依賴性活性[43]，長期的尸檢間隔時間(PMI)可能會低估TAU磷酸化水平[44]。活檢來源患者大腦TAU不會因組織中的內(nèi)源性磷酸酶而經(jīng)歷極快的去磷酸化作用[25]。但是相較于正常人，AD患者死后驗尸延遲期間的磷酸化位點迅速脫磷酸化程度低，這可能是由于蛋白質(zhì)磷酸酶活性不足以及TAU的聚集所致[7]。

6 總 結(jié)

AD是一種復(fù)雜的多因素疾病。AD典型的病理標(biāo)志是NFT和細(xì)胞外的SP。多達(dá)30%的正常老年人大腦中的Aβ斑塊負(fù)荷與AD的典型病例一樣多，但是他們?nèi)狈β斑塊周圍的TAU病理性營養(yǎng)不良性神經(jīng)突[45]。免疫療法是在AD治療領(lǐng)域最有希望的方法之一。但是，針對Aβ的免疫療法臨床試卻驗接連失敗，主要原因之一是大腦中的Aβ負(fù)荷與癡呆程度無關(guān)。靶向TAU的免疫療法是針對Aβ免疫療法失敗之后的新方向。AD病理毒性，主要是由于TAU過度磷酸化所致[46]，所以對TAU磷酸化位點的研究，將會為更有效的治療提供靶點。同時，AD患者CSF與大腦中的TAU磷酸化位點不全相同，CSF中TAU磷酸化位點研究將為AD診斷的生物標(biāo)志物提供有意義的依據(jù)。

不同的實驗研究對象及方法會出現(xiàn)不同的實驗結(jié)果。鼠和人腦TAU磷酸化位點不全相同；由于磷酸激酶與磷酸酶的變化，相對于活檢，尸檢TAU磷酸化位點減少；Western、Elisa、免疫組化、Dot-Blot等實驗方法的不同，也會使得實驗結(jié)果有偏差?，F(xiàn)在，質(zhì)譜法、ipsc等方法為研究TAU磷酸化位點提供新的思路，TAU磷酸化位點的研究前景也將會越來越明朗。