防疫藏藥九味麝香丸配方分解與生物堿含量分析

賽悟杰 ，米瑪卓嘎，朗 嘉

(1.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院，西藏 拉薩 850000)

藏醫(yī)藥防治疫病有多種方式方法，如口服藥、揮發(fā)性香囊、藏香熏法等，而最常用的藥物為九味黑藥丸.九味黑藥丸既可以做香囊掛在脖子，用其揮發(fā)物來防治疫病傳染，也可口服治療疫病，改善多種疫病的相關(guān)癥狀[1-2].本研究在防疫藏藥九味黑藥丸配方考證和藥性分解基礎(chǔ)上，將貢珠云丹嘉措《臨床札記·札記精粹》中記載的九味黑藥丸[3]配方稍作改變，以減毒提效.在原配方[3]中增加了訶子、細(xì)葉草烏葉及結(jié)血蒿膏.新配方組方為牛黃、阿魏、穆庫爾沒藥、藏菖蒲、藏青果、京墨、細(xì)葉草烏(榜那)、麝香、硫磺、訶子、細(xì)葉草烏葉、結(jié)血蒿膏等.此組方經(jīng)過西藏自治區(qū)藏醫(yī)院專家論證后命名為九味麝香丸，同時(shí)對九味麝香丸配方中生物堿含量進(jìn)行了測定.

1 九味黑藥丸配方比較

在藏醫(yī)藥學(xué)10余部文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)17種九味黑藥丸配方的不同記載，但各配方藥物的組成和劑量有不同點(diǎn)也有相同處，相同點(diǎn)是組成藥物均含有加工炮制的細(xì)葉草烏、藏菖蒲、麝香、穆庫爾沒藥等4種(見表1).

表1 藏醫(yī)文獻(xiàn)醫(yī)籍記載的九味黑藥丸

2 九味黑藥丸配方組成及功效分析

2.1 九味黑藥丸配方組成及功效分析

藏醫(yī)藥學(xué)治療疫病的主要方法為滅菌抗炎、清熱、補(bǔ)養(yǎng)[4].諸多藏醫(yī)學(xué)著作記載疫病病因是病菌，性質(zhì)屬熱性.藏醫(yī)學(xué)中闡述的疫病病情[5]也跟新冠肺炎疾病的癥狀[6]大致相同，其癥狀有身體虛弱、乏力、發(fā)燒、咳嗽、上腹部疼痛、下泄等，使體內(nèi)的五原紊亂進(jìn)而導(dǎo)致臟器衰弱，因此在藏醫(yī)學(xué)中利用滅菌抗炎、清熱、補(bǔ)養(yǎng)三種方法同時(shí)進(jìn)行來預(yù)防和治療突發(fā)的流行性疾病，但最主要的方法是滅菌抗炎，其次為清熱，最后為補(bǔ)養(yǎng).

九味黑藥丸配方組成的主次藥是根據(jù)藏醫(yī)學(xué)治療疫病方法進(jìn)行分類的，其中把有消炎滅菌功效的藥歸為主藥，清熱降溫藥歸為次藥，補(bǔ)養(yǎng)調(diào)理藥歸為其他藥.因此，九味黑藥丸[3]配方中的牛黃、穆庫爾沒藥、藏菖蒲、京墨、細(xì)葉草烏、麝香、硫磺等可歸為主藥，訶子(藏青果)為次藥，阿魏為其他藥.像這樣多種成分的藥物同時(shí)治療疾病來改善癥狀，增加體能的診療方法也是藏醫(yī)藥特色治療方法，這種方法更適合治療疫病.本配方中就發(fā)炎的治療藥物有牛黃、穆庫爾沒藥、藏菖蒲、京墨、細(xì)葉草烏、麝香等；滅菌的有阿魏、麝香、細(xì)葉草烏；改善發(fā)熱癥狀的有牛黃、穆庫爾沒藥、京墨、細(xì)葉草烏、麝香等；補(bǔ)養(yǎng)的有訶子(藏青果)、藏菖蒲、阿魏；消腫的有訶子(藏青果)、京墨、細(xì)葉草烏、麝香；治療膿腫黃水的有藏菖蒲、細(xì)葉草烏、硫磺；治療肺部病變的有訶子(藏青果)、牛黃；治療咽喉炎癥的有穆庫爾沒藥、細(xì)葉草烏、藏菖蒲；機(jī)體消炎的有穆庫爾沒藥、藏菖蒲、細(xì)葉草烏、硫磺等(見表2).

分析九味黑藥丸[3]制劑性味，五原結(jié)果中味苦7分、甘5分、辛5分、澀2分，稍酸1分.以味的大小來分析五原中水性12分、占30%，風(fēng)性14分、占35%，土性8分、占20%，火性6分、占15%.消化后味(藥物服用消化后的味)[7]苦8分、甘2分，水性10分占50%、風(fēng)性8分占40%、土性2分占10%.以此來分析，該藥主味為苦，五原為水，風(fēng)性作用相對較大，性為涼.

2.2 九味麝香丸配方功效分析

九味黑藥丸[3]中增加訶子、細(xì)葉草烏葉、結(jié)血蒿膏制成九味麝香丸，其中訶子為金光訶子，味澀、苦、甘、稍酸，消化后味苦，性能為涼熱均勻，效能為涼、輕，主要調(diào)節(jié)新陳代謝、補(bǔ)養(yǎng)和治療營養(yǎng)不良的疾病[8].據(jù)藏醫(yī)藥學(xué)記載，草烏含毒[2]，故需加訶子降低草烏的毒性來補(bǔ)養(yǎng)及調(diào)節(jié)代謝.草烏葉味甘、稍苦，消化后味甘，性能為涼熱均勻，效能為熱，主要用于止疼、抗炎[9].藏藥學(xué)記載草烏葉(榜那葉)對治療疫病更有效.結(jié)血蒿膏是常用治療疫病的藥物[10]，其味苦而辛，消化后味苦，藥性為涼，效能為輕而粗，主要功效是殺菌、抗炎、治療身體發(fā)炎及傷口膿腫，具有增強(qiáng)滅菌抗炎的功效.由此，該配方中增加訶子、細(xì)葉草烏葉、結(jié)血蒿膏，不僅可減輕毒性，還可增強(qiáng)滅菌抗炎功效.

表2 《臨床札記·札記精粹》中九味黑藥丸配方組成藥藥性分析

分析九味麝香丸制劑性味，五原結(jié)果中味苦10分、甘7分、辛6分、澀3分、稍酸2分.以味的大小來分析五原中水性17分、占30.4%，風(fēng)性19分、占34%，土性12分、占21.4%，火性8分、占14.3%.消化后味苦10分、甘3分，水性13分、占50%，風(fēng)性10分、占38.5%，土性3分、占11.5%，性為涼.

2.3 九味黑藥丸和九味麝香丸的五原與性味比較

對九味黑藥丸與九味麝香丸的五原、性味數(shù)據(jù)進(jìn)行(x2)檢驗(yàn)，結(jié)果水性和風(fēng)性有所區(qū)別，而性味差異比較明顯，味苦、甘、辛，消化后味苦最為明顯(見圖1),但兩組數(shù)據(jù)通過R系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

圖1 九味黑藥丸和九味麝香丸的五原與性味比較

3 九味麝香丸雙酯型生物堿含量測定

3.1 材料與儀器

Agilent1290型超高效液相色譜儀，Agilent6460型三重四極桿質(zhì)譜儀，MassHunter Qualitative Analysis B.03.00定性分析軟件，Mass Hunter Quantitative Analysis B.03.00定量分析軟件(美國Agilent公司)；ST16R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific公司)；SECURA225D-1CN電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q Integral 3型超純水機(jī)(美國Millipore公司).

九味麝香丸陰性樣品(缺榜那、榜那葉)、榜那、榜那葉由西藏自治區(qū)藏醫(yī)院制劑中心提供.氫溴酸高烏甲素(批號：100289-200902，含量以95.7%計(jì))，烏頭雙酯型生物堿對照提取物(批號112029-201601、新烏頭堿含量31.7%、次烏頭堿含量30.0%、烏頭堿含量31.8%)(均購自中國食品藥品檢定研究院).乙腈、甲醇，色譜純(美國Fisher公司)；甲酸，色譜純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；醋酸銨，色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純.

3.2 方法與測定結(jié)果

3.2.1 雙酯型生物堿含量測定方法

參照羅春梅、張意涵等建立的LC-MS檢測附子生物堿方法進(jìn)行測定[11-12].

3.2.1.1 色譜條件

Agilent SB-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱,柱溫35 ℃；流動(dòng)相為2 mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫：0～1.5 min，15%～20%乙腈；1.5～5 min，20%～70%乙腈；5～5.1 min，70%～100%乙腈；5.1～6.5 min，100%乙腈.體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣體積1 μL.

3.2.1.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測，毛細(xì)管電壓4 kV，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速11 L/min，霧化氣壓45 Pa.掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，3種生物堿及內(nèi)標(biāo)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜分析參數(shù)(見表3).

表3 3種生物堿及內(nèi)標(biāo)檢測離子質(zhì)譜分析參數(shù)

3.2.1.3 對照品儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取烏頭雙酯型生物堿對照品10.80 mg，置10 mL量瓶中，加0.05 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻.取上述對照品溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品儲(chǔ)備液(每1 mL含新烏頭堿6.865 μg、次烏頭堿6.48 μg、烏頭堿6.87 μg).

精密稱取氫溴酸高烏甲素對照品7.33 mg，折合氫溴酸高烏甲素7.23 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻.取上述溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得5.536 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液.

3.2.1.4 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定并加入0.05 mol·L-1鹽酸溶液25 mL，搖勻，超聲處理30 min，于12 000 r·min-1離心6 min.精密吸取上清液0.4 mL至10 mL量瓶中，加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，再加甲醇定容至刻度，搖勻，于12 000 r·min-1離心6 min，取上清液待測.

3.3 測定結(jié)果

3.3.1 線性關(guān)系

取對照品儲(chǔ)備液，按比例1∶2.5∶2∶2.5∶2∶2∶5∶10∶2逐級稀釋，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液.取上述對照品溶液各1.0 mL置10 mL容量瓶中，各加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，甲醇稀釋至刻度，即得一系列不同濃度的混合對照品溶液.進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X，ng·mL-1，對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，得到相應(yīng)的線性回歸方程，結(jié)果見表4.

表4 3種生物堿的線性方程及定量分析

3.3.2 雙酯型生物堿測定結(jié)果

按供試品溶液制備方法計(jì)算3種雙酯型生物堿在九味麝香丸中的定量下限，結(jié)果見表5.

表5 九味麝香丸雙酯型生物堿定量下限

九味麝香丸、陰性、榜那及榜那葉雙酯型生物堿含量測定結(jié)果見表6.

表6 九味麝香丸雙酯型生物堿測定結(jié)果(μg/g)

4 結(jié)果分析

藏醫(yī)學(xué)書籍記載有很多不同配方的九味黑藥丸，此藥丸可掛在脖子防疫，也可口服治療疫病，因配方不同具有滅菌、消炎、退熱、咽喉清熱、消腫，吸附肺部黏液，補(bǔ)養(yǎng)等作用.九味黑藥丸配方中增加金光訶子、細(xì)葉草烏葉、結(jié)血蒿膏制成的九味麝香丸的水性和風(fēng)性與前者有所不同，性味差異比較明顯.味苦、甘、辛，消化后味苦最為明顯.九味麝香丸的雙酯型生物堿烏頭堿和次烏頭堿顯陰性，新烏頭堿接近于定量下限，因此在臨床應(yīng)用中相對比較安全.本研究報(bào)道了九味麝香丸0.20 g/kg、0.10 g/kg組對二甲苯可致小鼠耳腫脹度降低，腫脹抑制率分別為32%和20%，提示其有抑制急性炎癥作用.0.20 g/kg組對小鼠棉球肉芽干重降低，對亞急性炎癥也有一定的作用.0.20 g/kg、0.10 g/kg可增強(qiáng)DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，0.20 g/kg組小鼠耳腫脹度和腫脹率均增高，0.10 g/kg組腫脹率增高，說明九味麝香丸在上述劑量中具有增強(qiáng)免疫反應(yīng)作用[13].

5 結(jié)論

九味黑藥丸配方中增加金光訶子、細(xì)葉草烏葉、結(jié)血蒿膏制成的九味麝香丸在臨床應(yīng)用中相對比較安全，并具有抗炎和提高免疫的增強(qiáng)藥效.