細胞焦亡中Caspase作用及與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性研究

黃玲巍，康碧靜，馬春英，喬自林，王家敏，楊迪，阿依木古麗·阿不都熱依木

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030;3. 西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室, 甘肅 蘭州 730030；4. 西北民族大學(xué) 實驗教學(xué)部，甘肅 蘭州 730030))

當(dāng)機體需要清除內(nèi)源性或外源性傷害時，部分細胞通過死亡的形式來維持有機體生命的正常延續(xù).較常見的四種細胞死亡形式有凋亡、壞死、自噬及焦亡[1].細胞焦亡作為一種最新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，與其他細胞死亡形式較相同，可誘發(fā)生物體產(chǎn)生更激烈更快的炎癥反應(yīng)，并與機體的免疫調(diào)控密切相關(guān).此外，細胞焦亡與很多疾病的發(fā)生發(fā)展存在復(fù)雜的關(guān)系[2].

1 細胞焦亡的概述

細胞焦亡(Pyroptosis)為細胞程序性死亡，與細胞凋亡(Apoptosis)、細胞壞死(Necrocytosis)和細胞自噬(Autophagy)不同的是它的發(fā)生過程需要半胱氨酸、天冬氨酸、蛋白水解酶(Caspases)及促炎細胞因子IL-1β、IL-18等的產(chǎn)生及釋放[3].通過細胞裂解清除細胞內(nèi)復(fù)制的病原體，以誘導(dǎo)進一步免疫反應(yīng)并調(diào)節(jié)細胞死亡的炎癥方式[4].焦亡的特點有核固縮、核溶解、形成凋亡小體，但細胞內(nèi)容物不會釋放到細胞外，因此焦亡過程不引發(fā)機體的炎癥反應(yīng)[5].不同的是細胞壞死由細胞生存的環(huán)境破壞引起，為細胞被動或者意外發(fā)生死亡的一種形式[6].細胞自噬是在細胞受到細胞內(nèi)或外刺激，如營養(yǎng)缺失所引起的應(yīng)激反應(yīng)，是細胞進行自我吞噬的死亡過程[7].

2 細胞焦亡的特征

1992年，研究人員在做侵襲性致病菌志賀氏菌和沙門氏菌感染巨噬細胞過程中，發(fā)現(xiàn)這兩種菌會分泌兩種效應(yīng)蛋白，激活巨噬細胞表達Caspase-1，引發(fā)細胞死亡[8]，此死亡過程先被歸類為細胞凋亡，后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)Caspase-1介導(dǎo)的細胞死亡和傳統(tǒng)的細胞凋亡差別較大.這種細胞死亡過程發(fā)生迅速，但細胞膜完整性破壞，伴隨明顯的炎癥反應(yīng)，為了方便從細胞凋亡中區(qū)分出來，作為另一種程序性死亡方式.隨著研究的深入，于2018年將細胞焦亡概念重新定義為：一種由Gasdermin家族蛋白和活化的炎癥性Caspase介導(dǎo)形成質(zhì)膜孔的可調(diào)控的細胞死亡方式[9].多種物質(zhì)可以通過刺激模式識別受體，激活焦亡相關(guān)信號通路，產(chǎn)生細胞因子，使細胞膨脹、細胞膜破裂，從而引起細胞焦亡.

焦亡的細胞會產(chǎn)生核固縮、染色質(zhì)DNA斷裂等狀態(tài)，這與凋亡相似，不同的是細胞焦亡發(fā)生于被病毒或細菌感染的細胞，細胞凋亡則是發(fā)生于沒被病毒和細菌感染的正常細胞.細胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征首先細胞膜上會形成10～15nm小孔，使胞內(nèi)離子平衡破壞，導(dǎo)致外界水分內(nèi)流進入，細胞表現(xiàn)為腫脹，最終細胞破裂發(fā)生滲透性溶解，并引起周圍組織炎癥[10].細胞凋亡的典型特征為細胞充盈、染色質(zhì)聚集濃縮致DNA損傷，形成凋亡小體，但細胞膜及膜性細胞器生物膜完整，不引起周圍組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[11]，細胞焦亡像細胞凋亡一樣，均為細胞自殺，兩者結(jié)果又顯著不同[12].細胞焦亡發(fā)生的機制：胞膜內(nèi)陷，包裹胞內(nèi)容物，形成凋亡小體，細胞發(fā)生腫脹，胞膜受力不均，在細胞膜上會形成小孔，導(dǎo)致細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性破壞，引發(fā)膜內(nèi)外的離子失去平衡，細胞內(nèi)滲透壓升高，水從孔隙中流入，細胞膜破裂，促炎因子IL-1β、IL-18等大量滲出，募集周圍更多炎性細胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng).

表1 四種細胞死亡形式對比

3 細胞焦亡的分子機制

目前已發(fā)現(xiàn)的細胞焦亡主要有三種途徑：1)經(jīng)典細胞焦亡途徑；2)非經(jīng)典焦亡途徑；3)其他途徑.

3.1 細胞焦亡的經(jīng)典途徑

細胞焦亡過程的經(jīng)典途徑：炎性小體首先激活Caspase-1后，活化的Caspase-1通過切斷GSDMD產(chǎn)生的N端，誘導(dǎo)細胞焦亡.細胞內(nèi)外存在有關(guān)細胞死亡的多種模式識別受體，當(dāng)細胞受到胞外損傷相關(guān)模式分子或病原體相關(guān)模式分子刺激時[17]，促進炎性小體組裝相關(guān)蛋白進行化.研究較為廣泛的炎性小體為NLRP3炎性小體，其由模式識別受體(NOD-like receptors，NLRs)、黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)、Pyrin、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和Caspase-1前體(Pro-Caspase-1)四部分構(gòu)成[18]，活化步驟主要分為兩步，首先，Toll樣受體或細胞內(nèi)源性因子產(chǎn)生的炎性刺激使其活化，當(dāng)缺氧時，可在無菌的炎性環(huán)境中被激活.其次，由胞外損傷相關(guān)模式分子和病原體相關(guān)模式分子引發(fā)K+外排、Ca2+通量增加、溶酶體損傷或ROS產(chǎn)生后，最終導(dǎo)致NLRP3炎性小體被活化[19]，再進一步激活Caspase-1蛋白.Caspase蛋白的家族成員共有14種蛋白[20]，其中Caspase-1參與炎性反應(yīng)并可誘導(dǎo)細胞焦亡的產(chǎn)生，Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11同樣也和細胞焦亡有關(guān)[21].Caspase-3、Caspase-9[22]、Caspase-10參與細胞凋亡，Caspase-8則和焦亡及凋亡都存在聯(lián)系[23].

Caspase-1開始稱為IL-1β轉(zhuǎn)換酶[24]，因其活化后可以剪切pro-IL-1β和pro-IL-18成為有活性的IL-1β、IL-18；而后因其活性位點包含半胱氨酸殘基，可特異性識別并切割靶蛋白的天冬氨酸殘基上肽鍵，故得名Caspase-1.Gasdermins為焦亡的執(zhí)行者，導(dǎo)致炎癥細胞死亡，并伴有各種炎癥介質(zhì)[25].Caspase-1可以切割Gasdermin家族蛋白的Gasdermin D(GSDMD).GSDMD于2015年初次發(fā)現(xiàn)其和炎性Caspase相關(guān)的底物蛋白有關(guān)[26].GSDMD由N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-N)和C端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-C)兩個結(jié)構(gòu)域組成，完整的GSDMD是沒有活性的.活化的Caspase-1對完整的GSDMD進行切割后，GSDMD-C與GSDMD-N分離并解除C端結(jié)構(gòu)域?qū)端結(jié)構(gòu)域的抑制作用[27]，形成具有活性的N末端p30片段[28]，16個N末端片段相互組合形成直經(jīng)10-15nm的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，然后其錨定到細胞膜上，釋放細胞因子導(dǎo)致炎性細胞死亡[29].GSDMD-C與GSDMD-N重新結(jié)合后，重新對細胞焦亡產(chǎn)生抑制作用.

Caspase蛋白家族成員Caspase-8在細胞焦亡和細胞凋亡發(fā)揮作用，它不僅可以激活NLRP3而且作為細胞焦亡Caspase-1途徑被抑制時的另一條通路，Caspase-8對GSDMD的切割位點雖然與Caspase-1相同，但其切割GSDMD效率比Caspase-1低很多[30].炎癥小體作為細胞焦亡經(jīng)典途徑的核心，活化機制并未獲得統(tǒng)一，相較于Caspase-8，Caspase-1途徑肯定是首先發(fā)揮作用[31].因此，整合各類刺激條件可以激活炎癥小體中的發(fā)揮作用，這是未來研究細胞焦亡特別需要解決的問題之一.

3.2 細胞焦亡的非經(jīng)典途徑

細胞焦亡非經(jīng)典途徑是對革蘭氏陰性菌獨特的免疫反應(yīng)[32].革蘭氏陰性細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可以直接結(jié)合Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11誘導(dǎo)細胞焦亡，此過程不需要Caspase-1的參與.另有研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜半通道蛋白Pannexin-1可通過開放自身通道，參與細胞焦亡的非經(jīng)典途徑[33].首先，LPS通過轉(zhuǎn)染進入胞漿，隨后Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11被激活.激活后的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11通過裂解GSDMD形成N端p30結(jié)構(gòu)，形成膜孔來破壞細胞功能，觸發(fā)細胞焦亡.其也可觸發(fā)縫隙連接蛋白(Pannexin-1，Panx-1)通道的開放，促進K+外排，誘導(dǎo)激活NLRP3炎癥小體以及IL-1β釋放.Panx-1通道可釋放的ATP，然后通過激活嘌呤能受體蛋白P2X7(purinergic receptor P2X ligand-gatedion channel 7)的受體，促進K+外排并刺激炎癥小體的組裝，最終使細胞焦亡.在非經(jīng)典焦亡通路中，焦亡過程不需要Caspase-1，但需要Caspase-1活化，并介導(dǎo)IL-1β和IL-18的分泌.目前對細胞焦亡非經(jīng)典途徑的研究尚不全面，與焦亡經(jīng)典途徑之間的關(guān)系還需深入研究.

圖1 細胞焦亡的三條通路

3.3 細胞焦亡的其他途徑

除上述的細胞焦亡兩種途徑被發(fā)現(xiàn)外，Caspase-3是一種廣泛表達的保守蛋白質(zhì)家族成員，其也在調(diào)節(jié)正常和惡性細胞及組織的生長和維持體內(nèi)平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[34].Caspase-3通過切割Gasdermin家族中另一成員Gasdermin E(GSDME)生成N-末端片段(GSDME-N)，隨后N端通過在細胞膜上形成孔，最終引起細胞焦亡.但是GSDME蛋白只能與Caspase-3特異識別和切割，并不與Caspase家族其他成員反生反應(yīng)[35].當(dāng)腫瘤細胞中的GSDME表達量高時，化療藥物處理完腫瘤細胞后，使Caspase-3活化后識別GSDME，導(dǎo)致細胞焦亡控制腫瘤細胞繼續(xù)生長.細胞中還存在一種ESCRT介導(dǎo)的孔修復(fù)機制可修復(fù)和延緩細胞死亡[36]，因此GSDME表達量的高低可以影響細胞的走向是凋亡還是焦亡，所以GSDME表達量較低時細胞發(fā)生凋亡，GSDME表達水平高或中等的細胞發(fā)生焦亡[37].細胞焦亡的這種途徑被發(fā)現(xiàn)于腫瘤細胞中，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有較高的地位，現(xiàn)已成為一種可以降低腫瘤細胞的耐藥性，提高抗腫瘤藥物治療能力的新方法.

4 細胞焦亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)系

腫瘤(Tumour)，大部分是由于細胞的異常病變產(chǎn)生的，根據(jù)其特性可分為良性腫瘤與惡性腫瘤.良性腫瘤主要是當(dāng)腫瘤細胞增殖較為緩慢，以及其在周圍正常的組織形成包膜比較光滑并且有著明顯分界的腫瘤.惡性腫瘤指腫瘤細胞的分裂存在嚴重失控，同時向周圍組織遷移和侵襲，并由淋巴循環(huán)和血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到機體其他組織與器官[38].很多因素決定腫瘤的形成，主要原因有：①原癌基因與抑癌基因的相對活性；②免疫微環(huán)境；③炎性微環(huán)境都相關(guān).導(dǎo)致許多慢性炎癥疾病的發(fā)病機制與細胞焦亡有關(guān)[39].

研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡與腫瘤存在重要的聯(lián)系[40]：①細胞焦亡可以釋放出多種促進炎性反應(yīng)的因子，炎性反應(yīng)是腫瘤形成的特征，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性存在密切關(guān)系；②細胞焦亡作為一種程序性細胞死亡方式，可以抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.通過以上兩個研究方向，可使腫瘤的死亡達到治療的目的.在腫瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)炎性小體的存在，這些炎性小體對腫瘤細胞的生長存在雙重作用，既可以促進也可以抑制腫瘤的生長[41].炎性小體為引導(dǎo)Caspase-1進行細胞焦亡的關(guān)鍵分子，其存在可能是細胞焦亡和腫瘤相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵.研究發(fā)現(xiàn)[42]，當(dāng)將敲除細胞焦亡有關(guān)炎癥復(fù)合物相關(guān)基因后，會增加小鼠結(jié)腸癌的發(fā)生.此實驗則證實了細胞焦亡過程中涉及Caspases-1、Caspases-3、Caspases-4、Caspases-5、Caspases-11以及具有微妙作用的Caspases-8，后續(xù)切割的蛋白GSDMD蛋白、GSDME蛋白、后續(xù)釋放出的炎癥因子如IL-1β、IL-18以及與細胞焦亡的相關(guān)可能在機體腫瘤的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用.

4.1 Caspases家族蛋白及GSDMD蛋白和GSDME蛋白與腫瘤形成的關(guān)系

通過以上論述可以發(fā)現(xiàn)Caspase家族可以誘導(dǎo)細胞焦亡，但是當(dāng)其活化不足時反而會導(dǎo)致機體發(fā)生腫瘤感染性增加.關(guān)于Caspase依賴性的細胞焦亡可能是研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展進程以及相關(guān)治療的新的突破點[30].首先關(guān)于腫瘤和Caspase-1的相關(guān)性，Caspase家族對于腫瘤的生長存在促進作用.并且通過閱讀文獻還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠體內(nèi)的NLRP3缺陷時，其Caspase-1活化會受到抑制，那么體內(nèi)的IL-1β水平會降低，然后可以使小鼠結(jié)腸炎的病癥得到改善，從而使其患癌癥風(fēng)險大幅度的下降[43].與Caspase-3的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤細胞的GSDME表達量較高時，使用可以導(dǎo)致DNA損傷的化療藥物處理腫瘤細胞在Caspase-3活化后，細胞不會走凋亡的路線，而是去識別內(nèi)源性GSDME的靶位點，最終導(dǎo)致細胞焦亡[44].有研究表明，Caspase-3也可以識別并切割GSDMD-N端結(jié)構(gòu)域，從而抑制細胞焦亡[45].腫瘤和Caspase-4、Caspase-11的相關(guān)性則表現(xiàn)為細胞內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶8(GSH-Px8)可以抑制Caspase-4和Caspase-11激活的作用，原理是通過GSH-Px8的半胱氨酸和caspase-4的半胱氨酸之間形成二硫鍵可以與Caspase-4和Caspase-11進行共價結(jié)合，從而抑制細胞焦亡的發(fā)生.如果在缺少GSH-Px8基因的巨噬細胞中，Caspase-4和Caspase-11因為沒有被抑制而活性增強，繼而發(fā)生非經(jīng)典途徑焦亡及炎性因子的釋放[46].當(dāng)使用洛鉑可以誘導(dǎo)壞死性凋亡小體的形成，從而促進經(jīng)典途徑介導(dǎo)的細胞焦亡發(fā)生，使用Caspase-8的抑制劑后，會削弱了這種效應(yīng)，由此證實Caspase-8位于Caspase-3的上游，并在細胞焦亡中發(fā)揮作用[47].雖然Caspase-8發(fā)揮的作用以及更多通路沒有研究出來但可以作為新的突破點，Caspase-8可以在一定意義上代替Caspase-3發(fā)揮作用.

在細胞焦亡的途徑中GSDMD蛋白對腫瘤的發(fā)生存在抑制作用，有關(guān)胃癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD蛋白可能通過抑制焦亡細胞的某種通路，導(dǎo)致細胞分裂周期的S期與G2期停止，來抑制胃癌增殖.相反，如果胃癌細胞存在較低水平的GSDMD蛋白，可能會導(dǎo)致細胞周期S/G2轉(zhuǎn)換加速，并由此促進胃癌細胞的增殖[48].所以，GSDMD蛋白表達量的高低，對腫瘤不僅有抑制作用還有促進生長的作用，并且兩種不同的作用可能和腫瘤的種類大有聯(lián)系[49].例如，對于肺鱗狀細胞癌，GSDMD蛋白表達量高可能發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，然而，在肺腺癌中表達量較高，就發(fā)揮促進作用.有研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中GSDMD蛋白表達水平與癌旁組織、與患者腫瘤體積成正相關(guān)[50].GSDMD蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程一定是相關(guān)聯(lián)的，但是發(fā)揮的作用需要進行更多的實驗去研究發(fā)現(xiàn).

研究宮頸癌與胃癌細胞發(fā)現(xiàn)，GSDME蛋白能將Caspase-3介導(dǎo)的凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡，可加速細胞死亡[51].在肝癌細胞中Caspase-1，IL-1β和IL-18的表達水平比癌旁細胞較低，與此同時細胞中GSDME蛋白表達量明顯降低，GSDME表達高時，肝癌細胞的增殖活動受到明顯抑制[52].另有實驗證明，當(dāng)在敲除小鼠的GSDME蛋白，小鼠出現(xiàn)組織損傷、體重下降的情況要比GSDME野生型小鼠的情況好些.所以，化療藥物可激活Caspase-3，并使GSDME蛋白誘導(dǎo)腫瘤周圍正常細胞發(fā)生焦亡，并引發(fā)正常組織炎癥損傷，這個觀點剛好又一次從側(cè)面證明了細胞焦亡的其他途徑.

GSDME介導(dǎo)的細胞焦亡可導(dǎo)致正常組織產(chǎn)生炎癥損傷，并引發(fā)部分化療毒副作用，通過調(diào)控GSDME表達水平可能是控制部分化療不良副作用的有效手段.而且GSDME可以通過啟動子甲基化修飾，從而導(dǎo)致GSDME蛋白表達量降低或者不表達的方式，參與到腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移.這就使得GSDME蛋白成為潛在的抑癌基因，如果抑制或逆轉(zhuǎn)GSDME基因甲基化，這種方式可能成為抗腫瘤治療的新靶點[53].

4.2 IL-1β、IL-18與腫瘤形成的關(guān)系

由此可見兩種細胞焦亡產(chǎn)生的炎癥因子與細胞成瘤性的具體機理目前尚不清楚，還需要進行大量實驗證明.

5 總結(jié)展望

細胞焦亡，最初發(fā)現(xiàn)于2000年，是一種溶解性和炎性細胞死亡的形式，特征是質(zhì)膜上形成孔使細胞腫脹和破裂，并有大量炎癥因子IL-1β、IL-18的釋放.焦亡的主要功能，誘導(dǎo)細胞成熟強烈的炎癥反應(yīng)，從而保護宿主細胞免受微生物等病菌的感染.但是過度的細胞焦亡也會導(dǎo)致炎癥性疾病，如敗血癥和自身免疫病.細胞焦亡中，研究最廣泛的為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，當(dāng)微生物感染時，經(jīng)典途徑響應(yīng)病原菌相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)；而非經(jīng)典途徑響應(yīng)革蘭氏陰性菌的胞內(nèi)脂多糖(LPS)[58].腫瘤的發(fā)生有很多因素，包括：原癌基因和抗癌基因的相對活性、細胞中的免疫微環(huán)境、產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)、慢性炎癥的發(fā)生等.腫瘤細胞焦亡時，炎癥小體產(chǎn)生抑制腫瘤發(fā)生的作用，細胞的生長受到抑制而表現(xiàn)出抗腫瘤活性.但是，細胞焦亡過程中會伴隨著炎性因子的釋放，激活產(chǎn)生促細胞周期激酶，故形成有利于腫瘤生長的微環(huán)境，促進腫瘤生長[59].細胞在炎癥環(huán)境可誘導(dǎo)正常細胞發(fā)生癌變，所以細胞焦亡形成的炎癥反應(yīng)環(huán)境可為腫瘤的生長提供了適宜環(huán)境，但是細胞焦亡過程中涉及以及產(chǎn)生的各種物質(zhì)卻在一定程度上抑制了腫瘤細胞增殖[60].研究表明，非編碼RNA(Noncoding RNAs,ncRNAs)被認為是重要的生物標志物和潛在疾病治療靶點，用于各種疾病的診斷和治療.ncRNA可以介導(dǎo)調(diào)控轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的焦亡相關(guān)基因，來參與焦亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[61].如果進一步探究細胞焦亡在不同腫瘤細胞中的機制以及腫瘤細胞與焦亡相關(guān)的，上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白相互作用，可為腫瘤的相關(guān)研究和治療開辟新的道路.研究還發(fā)現(xiàn)，可以通過中藥提取物調(diào)節(jié)細胞焦亡參與的NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路干預(yù)腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展，這也為深入了解細胞焦亡的分子機制提供依據(jù)[62].未來，細胞焦亡介導(dǎo)的細胞程序性死亡，可能會通過管理和調(diào)節(jié)多種癌癥，為腫瘤的治愈提供一種治療和選擇的希望[63].