雄全異株桂花不同花期光合和內(nèi)源激素的變化

張 成，王小燕△，王賢榮*，段一凡*，張 敏，施大偉，朱 躍，宋炎峰，柴子涵，李 嵐

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.木犀屬植物栽培品種國際登錄中心，江蘇 南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)作為我國十大傳統(tǒng)名花之一，同時擁有罕見的雄全異株繁育系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，雄性和兩性桂花在花芽分化的早期并無差異，但在分化后期，兩性株的兩個心皮愈合發(fā)育成1個完整的雌蕊，而雄株的兩個心皮未能愈合，最終導(dǎo)致雌蕊敗育[1-2]。在桂花完成花芽分化之后的開花階段，雄性和兩性桂花花瓣的脫落情況差異顯著。雄性桂花的花瓣在末花期大量脫落，而兩性桂花花瓣脫落較少，甚至基本不脫落。由于雄性桂花花瓣脫落且方便采收，因此雄性品種桂花通常用于食品、藥品和香精等產(chǎn)品的開發(fā)；而兩性桂花能夠產(chǎn)生種子，通常被用于播種繁殖，選育變異的新品種。

光合特性可以直接反映植物的生長發(fā)育狀態(tài)，因此越來越多的研究者將光合特性用作監(jiān)測植物在不同處理或脅迫下生長發(fā)育的主要生理指標(biāo)[3-4]。植物的內(nèi)源激素種類繁多，參與生長發(fā)育的各個階段。在花器官發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控過程[5-6]中，6-BA能夠促進(jìn)鈍葉柃(Euryaobtusifolia)雄性器官的發(fā)育，而茉莉酸甲酯(MeJA)能使歐洲油菜(Brassicanapus)提前開花，但同時會引起花絲變短，導(dǎo)致雄性不育[7-8]。桂花在花芽分化階段完成性別分化，然而雄性和兩性桂花花瓣的脫落情況差異顯著，并且缺乏花期階段基礎(chǔ)的生理數(shù)據(jù)。本研究比較雄性和兩性桂花在不同花期的光合及內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律，為評價雄性和兩性桂花生長適應(yīng)性及其生理生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)正常生長的雄性(male,代號M)及兩性(hermaphroditic，代號H)桂花，2020年9—10月依據(jù)開花狀態(tài)，分別在初花期(少量開放、多數(shù)半閉合狀態(tài))、盛花期(開放量大于80%)和末花期(盛花期后2～3 d，且有陸續(xù)落花)進(jìn)行光合測量并采集用于激素測定的花部組織材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同花期光合生理特性的測定

選取生長狀況良好，無病蟲害的雄性和兩性桂花各4株，選取每株樹冠不同方向中上部8片健康成熟的葉片，分別在初花期、盛花期和末花期天氣晴朗的9:00—12:00，利用Li-6400XT(LI-COR，美國)便攜式光合作用測量系統(tǒng)進(jìn)行光合作用的測量，在光合有效輻射強(qiáng)度800 μmol/(m2·s)、樣品室CO2流速為500 μmol/s的條件下，記錄植株凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)及飽和水汽壓差(Vpdl)等光合指標(biāo)[9-10]。

1.2.2 不同花期花部組織激素含量的測定

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)對生長素(IAA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和玉米素核苷(ZRs)5種植物激素含量進(jìn)行測定，每個花期的雄花和兩性花均重復(fù)3次。稱取新鮮的不同花期雄性和兩性桂花各1 g，加2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，4 ℃冰箱中提取4 h，3 500 r/min離心10 min, 取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻， 4 ℃冰箱中再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積。上清液過C-18固相萃取柱，過柱后的樣品轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，真空濃縮干燥或用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容，搖勻后用于激素含量測定。具體測定方法參照Zhao等[11]進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

參照文獻(xiàn)[12-13]，計(jì)算如下指標(biāo)：光合作用葉片的水分利用率(EWUE)=Pn/Tr，氣孔限制值(LS)=(1-Ci/Ca)×100%(Ca為參比室CO2濃度)，葉片羧化速率(CE)=Pn/Ci。采用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 24.0分析光合參數(shù)相關(guān)性，用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花期桂花主要光合參數(shù)變化趨勢

對雄性和兩性桂花的初花期、盛花期和末花期進(jìn)行光合作用的測定，結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1可知，雄性桂花的凈光合速率在3個階段均低于兩性桂花的。雄性桂花凈光合速率(Pn)呈先下降再上升的趨勢，兩性桂花凈光合速率在初花期為最高，隨著花期的推移逐漸降低(圖1A)。雄性和兩性桂花的氣孔導(dǎo)度(Gs)均呈先下降后上升的變化趨勢，且末花期的氣孔導(dǎo)度均大于初花期(圖1A)。胞間CO2濃度(Ci)與蒸騰速率(Tr)的變化趨勢一致，均隨著花期的推移而逐漸上升，在末花期達(dá)到最高峰；初花期和盛花期雄性桂花的胞間CO2濃度高于兩性桂花，但兩性桂花從盛花期到末花期階段內(nèi)，胞間CO2濃度快速升高，最終在末花期超過雄性桂花的含量(圖1B)。蒸騰速率和胞間CO2濃度變化趨勢一致，都隨著花期的推進(jìn)而不斷升高，但與胞間CO2濃度不同的是，兩性桂花的蒸騰速率在不同花期均高于雄性桂花的(圖1B)。

圖1 雄性和兩性桂花在不同花期光合作用主要參數(shù)變化趨勢Fig.1 Trends of main photosynthetic parameters of male and hermaphroditic Osmanthus fragrans at different flowering stages

2.2 不同花期桂花凈光合速率與蒸騰速率變化

經(jīng)相關(guān)性分析(表1)可知，不同花期雄性桂花的凈光合速率與氣孔導(dǎo)度變化趨勢一致，且平均相關(guān)性系數(shù)為0.634 3，達(dá)到極顯著正相關(guān)(P< 0.01)；與雄性桂花類似，兩性桂花在不同花期的凈光合速率與氣孔導(dǎo)度也呈正相關(guān)，說明氣孔導(dǎo)度是影響桂花凈光合速率的一個主要因子；此外，兩性桂花在不同花期的凈光合速率與水汽壓差呈極顯著負(fù)相關(guān)，平均相關(guān)性為-0.481 3 (P< 0.01)。雄性和兩性桂花的蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度都呈正相關(guān)，表明更大的氣孔導(dǎo)度和更高的胞間CO2濃度會加速桂花葉片水分的蒸騰。值得注意的是，雄性桂花的凈光合速率與胞間CO2濃度在初花期和末花期為極顯著負(fù)相關(guān)，而兩性桂花的凈光合速率與胞間CO2濃度在初花期和盛花期分別為顯著正相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)。并且雄性和兩性桂花的蒸騰速率與飽和水汽壓差的相關(guān)性在末花期也截然相反。

表1 雄性和兩性桂花凈光合速率、蒸騰速率與環(huán)境因子的相關(guān)性

2.3 不同花期桂花的水分利用率、氣孔限制值和葉片羧化速率

凈光合速率與蒸騰速率的比值即為水分利用率(EWUE)，雄性和兩性桂花的蒸騰速率隨著花期的推進(jìn)呈不斷上升趨勢，凈光合速率整體呈下降趨勢，因此水分利用率在花期內(nèi)逐漸降低；兩性桂花末花期蒸騰速率迅速升高，所以導(dǎo)致末花期兩性桂花水分利用率低于雄性桂花的(表2)。

表2 雄性和兩性桂花的水分利用率、氣孔限制值及葉片羧化速率

不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)。Different lowercase letters showed significant differences(P < 0.05).圖2 雄性和兩性桂花在不同花期的5種激素含量Fig.2 The five hormones content in male and hermaphroditic O. fragrans at different flowering stages

在初花期和盛花期兩性桂花的胞間CO2濃度低于雄性桂花，所以這兩階段的氣孔限制值(LS)高于雄性桂花；但在末花期，兩性桂花的胞間CO2濃度迅速升高，甚至超過雄性桂花的胞間CO2濃度，此時兩性花的氣孔限制值迅速降低至35.94%，低于雄花的42.22%。因此推測，不同花期的胞間CO2濃度是影響氣孔限制值的關(guān)鍵因素。胞間CO2濃度越低，氣孔限制值越大，能夠進(jìn)入氣孔的CO2減少，光合作用降低。葉片羧化速率(CE)是凈光合速率和胞間CO2濃度的比值。在3個花期內(nèi)，兩性桂花的凈光合速率不斷降低，且胞間CO2濃度持續(xù)升高，因此兩性桂花的葉片羧化速率從初花期到末花期一直降低。但由于兩性花的凈光合速率在不同花期持續(xù)高于雄性桂花，因此在整體上，兩性桂花的葉片羧化速率高于雄性桂花。

2.4 不同花期桂花的激素含量測定結(jié)果分析

利用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對雄性和兩性桂花5種植物激素進(jìn)行測定(圖2)。整體來看，在兩性桂花中含量最高的激素為脫落酸(ABA)，雄花和兩性花不同花期的平均含量分別為124.75和90.72 ng/g，表明ABA在桂花的花期中發(fā)揮重要作用；含量最低的激素為赤霉素(GA3)，雄花和兩性花不同花期的平均含量分別為3.16和2.72 ng/g。雄花和兩性花的生長素(IAA)含量在不同花期差異變化不大，雄花IAA的平均含量略高于兩性花的含量，分別為22.88和19.39 ng/g。雄花的茉莉酸(JA)含量在不同花期均顯著高于兩性花，并且在雄花中，隨著花期的延長，JA的含量逐漸升高，并在末花期達(dá)到最高峰；雄花的玉米素核苷酸(ZRs)含量在花期的變化表現(xiàn)為先上升在下降的趨勢，而兩性花的ZRs含量則一直升高。

3 討 論

植物在長期的演化過程中為適應(yīng)各種復(fù)雜的環(huán)境因素，逐漸出現(xiàn)了性別分化。而性別分化之后，同種植物不同性別的個體在生長特征、生理生化特性以及基因表達(dá)等方面均存在差異[14-16]。桂花為雄全異株繁育系統(tǒng)，同時擁有雄性和兩性植株，筆者對能直接反映植物生長發(fā)育狀態(tài)的光合特性以及體現(xiàn)植物基礎(chǔ)生理特征的內(nèi)源激素含量進(jìn)行測定研究。結(jié)果表明，氣孔導(dǎo)度與凈光合速率呈正相關(guān)，并且決定了通過氣孔進(jìn)入細(xì)胞參與光合作用的CO2的量[17]，所以兩性桂花的氣孔導(dǎo)度、凈光合速率與葉片羧化速率在不同花期均大于雄性桂花。這是因?yàn)樾坌怨鸹ㄈ~片通過光合作用積累的物質(zhì)與能量只需要滿足花瓣和花藥的發(fā)育，但兩性桂花同時也需要為后續(xù)果實(shí)的發(fā)育積累更多的物質(zhì)與能量。因此，兩性桂花在末花期階段，蒸騰速率和胞間CO2濃度快速增加，導(dǎo)致兩性桂花水分利用率變低，葉片羧化速率變慢，此時凈光合速率減慢，只需為后續(xù)果實(shí)的發(fā)育提供保障。在3個花期中，兩性桂花的氣孔導(dǎo)度與ABA含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，整體呈正相關(guān)； 這與前人研究結(jié)果一致[18-19]，即ABA作為內(nèi)源激素能夠調(diào)控氣孔開度，并且在末花期，ABA含量的上升對果實(shí)的發(fā)育起著積極作用。

5種激素含量的測量結(jié)果表明，雄性和兩性桂花GA3的含量在測量的5種激素中均為最低，IAA的含量在不同花期變化不顯著，因此本研究推測，GA3與IAA兩種激素在不同性別桂花的花期中可能起到的調(diào)控作用較小。此外，在兩種性別的桂花中平均含量最高的激素為ABA，前人研究表明外源ABA處理能夠加快牡丹(Paeoniasuffruticosa)和芍藥(Paeonialactiflora)的衰老進(jìn)程[20-21]，而雄性桂花ABA的含量始終高于兩性桂花的，并且在雄花初花期至末花期的過程中呈現(xiàn)上升趨勢，在末花期達(dá)到峰值；與ABA的表達(dá)模式類似，雄性桂花JA的含量高于兩性桂花的，并且隨著花期的進(jìn)行，JA的含量不斷升高。在擬南芥中，JA的含量誘導(dǎo)H2O2的積累及衰老相關(guān)基因的表達(dá)升高，最終導(dǎo)致葉片衰老[22-23]。因此，筆者結(jié)合前人研究[24]，推測雄花中ABA和JA的大量積累可能與雄花花瓣的衰老和大量脫落相關(guān)。ZRs與ABA、JA的表達(dá)趨勢不同，ZRs在兩性花中不斷累積。已有研究表明ZRs在花芽分化期間含量呈上升趨勢，能夠促進(jìn)桂花的花芽分化[25]，結(jié)合本次研究花期中ZRs的變化趨勢，筆者推測ZRs能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，并在開花之后果實(shí)的發(fā)育過程中也發(fā)揮積極的作用。