基于模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁工藝

劉姝琪，劉 韓，余長(zhǎng)金，梁寒路，吳怡林，冉軍艦

（河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

近年來(lái)，菠蘿汁或橙汁等熱帶果汁和蔬菜汁的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵飲料受到歡迎[1]。發(fā)酵果蔬汁滿足了素食主義者、乳糖不耐受和高膽固醇人群的需求，顯示較好的發(fā)展勢(shì)頭[2]。利用植物乳桿菌發(fā)酵果汁有助于增強(qiáng)黏膜屏障，降低血清膽固醇，刺激免疫系統(tǒng)，抑制腸道炎癥，減輕腹瀉癥狀和增強(qiáng)抗誘變活性[3-5]。

梨是中國(guó)第三大水果，含有豐富的維生素、纖維素以及熊果苷、綠原酸、香草醛等多酚類物質(zhì)，具有止咳、潤(rùn)肺、降血壓和抗氧化等功效[6]；沃柑（沃桔）口感甜柔、低酸爽口，含有大量的維生素；胡蘿卜中含有的多分枝胡蘿卜素是維生素A的主要來(lái)源[7]，維生素A可以促進(jìn)生長(zhǎng)，防止細(xì)菌感染，以及保護(hù)表皮組織等上皮細(xì)胞組織的功能與作用；胡蘿卜還含有一種檞皮素，能夠增加冠狀動(dòng)脈血流量，促進(jìn)腎上腺素合成，有降壓、消炎之功效[8-9]。本試驗(yàn)采用植物乳桿菌對(duì)梨、沃柑、胡蘿卜復(fù)合果蔬汁進(jìn)行發(fā)酵，確定優(yōu)化工藝條件，并測(cè)定樣品中活菌數(shù)，以期為發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的工藝研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

沃柑、胡蘿卜、梨、白砂糖購(gòu)于新鄉(xiāng)市世紀(jì)華聯(lián)超市，其他試劑均為分析純。

JT1003D 型分析天平，上海力辰儀器科技有限公司；SN-HT 型甜度儀，浙江力辰儀器科技有限公司；WBL2501B型榨汁機(jī)，美的集團(tuán)有限公司；XD-CJ超凈工作臺(tái)，江蘇迅迪儀器科技有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵復(fù)合果蔬汁制作工藝流程

新鮮果蔬清洗、去皮及去核，取橙子100 g、胡蘿卜200 g、梨200 g，切塊，按照先加橙子、再加梨、最后加蘿卜的順序加入榨汁機(jī)中榨汁，300目濾布過(guò)濾2～3次，按比例加入純凈水進(jìn)行稀釋，并加入抗壞血酸2 g白砂糖5 g，爾后在75 ℃下進(jìn)行巴氏滅菌20 min，冷卻后接入植物乳桿菌發(fā)酵，最后將發(fā)酵復(fù)合果蔬汁置于4 ℃環(huán)境中進(jìn)行后發(fā)酵[10]，其目的在于抑制植物乳桿菌的生長(zhǎng)及促進(jìn)果蔬汁芳香物質(zhì)產(chǎn)生。

其制作工藝流程如下：胡蘿卜、橙子、梨挑選→清洗→去籽去皮→榨汁→過(guò)濾→發(fā)酵復(fù)合果蔬汁→滅菌→冷卻→接菌→發(fā)酵→后發(fā)酵→成品

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)不同果蔬質(zhì)量比進(jìn)行榨汁，最終確定采用橙子∶胡蘿卜∶梨為1∶2∶2的質(zhì)量比例（此時(shí)口感更佳），以進(jìn)行下面試驗(yàn)。固定發(fā)酵溫度（31 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（24 h）、接菌量（3%）、果汁添加量（50%）其中一個(gè)因素，分別考察發(fā)酵溫度（25、28、31、34、37 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（12、18、24、30、36 h）、接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）和果汁添加量（30%、40%、50%、60%、70%）對(duì)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)價(jià)的影響[11]。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素的試驗(yàn)結(jié)果以純果蔬汁添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量為因素，感官評(píng)定得分為試驗(yàn)指標(biāo)[9-11]，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[12-14]，采用4因素3水平響應(yīng)面進(jìn)行試驗(yàn)，感官評(píng)定小組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，從而優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁工藝（見(jiàn)表1）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 感官評(píng)定方法

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考《植物飲料》（GB/T31326-2014）的評(píng)價(jià)方法，根據(jù)實(shí)際情況制定感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。由5名從事食品加工的專業(yè)人員組成感官評(píng)定小組，對(duì)果蔬發(fā)酵汁的口感、色澤、香氣、體態(tài)4個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。在果蔬發(fā)酵汁感官分析中，采用估計(jì)評(píng)定法，總分為100分，由5位評(píng)定人員組成評(píng)定小組，取平均值。

表2 發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation table of fermented complex fruit and vegetable juice

圖1 果蔬汁感官綜合評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Figure 1 Radar diagram of sensory comprehensive evaluation of fruit and vegetable juice

1.2.5 模糊感官評(píng)定及模糊矩陣建立

在果蔬發(fā)酵汁感官分析中，選取因素集X=（口感，色澤，香氣，體態(tài)）?？谖?、香氣、色澤差距不大，所以將大部分分值放到口味進(jìn)行測(cè)評(píng)，對(duì)應(yīng)的評(píng)價(jià)集U=（優(yōu)，良，中，差），采用強(qiáng)制決定發(fā)權(quán)重集為X=（0.50，0.20，0.20，0.10），即口感0.5，色澤0.2，香氣0.2，氣味0.1。

食品感官指標(biāo)的綜合評(píng)定結(jié)果為Y，Y=X*R，其中X為權(quán)重，R為模糊矩陣[15]。

1.2.6 菌落總數(shù)的測(cè)定

通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 23軟件Duncan進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）（P＜0.05），利用Desgn-Expert 8軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及Origin 9軟件進(jìn)行結(jié)果圖繪制，每個(gè)處理進(jìn)行3次平行試驗(yàn)[17]，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖2A所示，隨著果蔬汁添加量的增加，感官評(píng)分先增加后減少。當(dāng)果蔬汁添加量為40%時(shí)，果蔬的味道較淡，不能體現(xiàn)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的口感，所以導(dǎo)致感官評(píng)分過(guò)低；當(dāng)果蔬汁的添加量為80%時(shí)，果蔬汁的比例更高，果酸含量更高，酸度過(guò)重，導(dǎo)致口感欠佳；當(dāng)果蔬汁添加量為50%時(shí)，發(fā)酵復(fù)合果蔬汁口感最好，風(fēng)味更佳，評(píng)分最高，為86.5分。

由圖2B可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分先增加后減少。當(dāng)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁發(fā)酵時(shí)間過(guò)短時(shí)，由于發(fā)酵程度不夠充分，發(fā)酵食品的特殊風(fēng)味不明顯，導(dǎo)致風(fēng)味不佳；當(dāng)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵過(guò)度，酸味增加甚至帶有刺激感，令人難以接受；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，評(píng)分為85.5分，感官評(píng)定最高，口感最佳。

由圖2C可知，感官評(píng)定得分隨著接菌量的增加呈現(xiàn)先增加后減少。在適當(dāng)?shù)谋壬L(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌的濃度成正比關(guān)系，因此隨著菌的濃度增大，產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，評(píng)分也越來(lái)越高[18-20]；而后隨著接菌量的持續(xù)增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中的成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的積累[21]，使評(píng)分降低。當(dāng)接菌量為3%時(shí)，感官評(píng)分最高，為85.3分，口味最佳。

由圖2D可知，隨著溫度上升，菌種活力增加，繁殖速度加快，發(fā)酵產(chǎn)生的特殊風(fēng)味充足，感官得分也越來(lái)越高；隨著溫度繼續(xù)上升，感官得分反而下降，其原因可能是由于該菌種不適宜在過(guò)高溫度下生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，口感欠佳。當(dāng)發(fā)酵溫度為31 ℃，評(píng)分最高，為86分，此時(shí)口感最佳。

圖2 不同因素對(duì)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)定的影響Figure 2 Effect of different factors on sensory evaluation of fermented complex fruit and vegetable juice

2.2 模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)在食品評(píng)價(jià)體系中起主導(dǎo)作用，但容易受到主觀因素影響，不能使產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)結(jié)果接近真實(shí)值，而模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法綜合考慮所有評(píng)定因素，使結(jié)果更客觀和合理。采用表3中的數(shù)據(jù)建立模糊評(píng)價(jià)矩陣[22]，將每個(gè)樣品的各自影響因素的得票數(shù)除以總參與評(píng)價(jià)人數(shù)（5）即可得到各個(gè)模糊矩陣R1～R27。以1號(hào)產(chǎn)品為例，色澤的評(píng)價(jià)人數(shù)分別為2人選優(yōu)，1人選良，2人選中，0人選差，則R色澤=（0.4，0.2，0.4，0），同理，R香氣=（0.2，0.6，0，0.2），R口感=（0.6，0.2，0.2，0），R體態(tài)=（0.2，0.6，0，0.2），由此可得到矩陣

表3 發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)價(jià)的投票結(jié)果Table 3 Voting results of sensory evaluation of fermented complex fruit and vegetable juice

同理，可以依次得到R2～R27的矩陣，根據(jù)模糊數(shù)學(xué)計(jì)算原理和權(quán)重集X=（X1，X2，X3，X4）=（0.50，0.20，0.20，0.10），按照矩陣相乘方法，感官評(píng)價(jià)結(jié)果Y1=X1×R1=（0.38，0.32，0.24，0.06）。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于Y中的各個(gè)量，分別賦予其相應(yīng)分值，優(yōu)、良、中、差分別為90分、80分、70分、60分，Y中各個(gè)值分別乘以相應(yīng)分值，再相加即可得到1號(hào)樣品感官評(píng)分，即1號(hào)樣品感官評(píng)分：Y1=0.38×90+0.32×80+0.24×70 + 0.06 × 60 = 80.2，同理可以計(jì)算出2～27 號(hào)樣品的感官得分。Y1…Y27 試驗(yàn)結(jié)果分別為：（0.38，0.32，0.24，0.06），（0.14，0.34，0.26，0.26），（0.36，0.16，0.46，0.02），（0.2，0.44，0.3，0.06），（0.34，0.2，0.28，0.18），（0.26，0.28，0.32，0.14），（0.18，0.22，0.24，0.36），（0.08，0.24，0.28，0.4），（0.04，0.48，0.28，0.2），（0.14，0.26，0.44，0.16），（0.16，0.32，0.28，0.24），（0.16，0.38，0.28，0.18），（0.26，0.28，0.14，0.32），（0.34，0.2，0.18，0.28），（0.44，0.24，0.28，0.04），（0.32，0.2，0.46，0.02），（0.24，0.28，0.1，0.38），（0.08，0.38，0.28，0.26），（0.08，0.38，0.3，0.24），（0.08，0.32，0.26，0.34），（0.3，0.28，0.42，0），（0.26，0.24，0.4，0.1），（0.16，0.14，0.48，0.22），（0.4，0.22，0.36，0.02），（0.32，0.16，0.36，0.16），（0.04，0.46，0.42，0.08），（0.22，0.22，0.42，0.14）。

由表4 建立二元線性回歸方程，Y=80.33-0.58A+0.16B-0.86C-0.75D-0.05AB-0.3AC-0.1AD-0.23BC+0.1BD+0.15CD-3.2A2-3.78B2-4.03C2+0.054D2。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Box-Behnken test scheme and results

由表5可知，模型中F值為8.15，差異性極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)為0.085，差異性不顯著，R2=0.904 6，Radj=0.793 3，說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值有高度相關(guān)性，可以反映90.46%的響應(yīng)面值變化，可用該模型對(duì)復(fù)合發(fā)酵果蔬汁做初步分析和預(yù)測(cè)。由F值可知各因素對(duì)感官評(píng)定影響大小順序?yàn)榻泳浚竟砑恿浚景l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model variance analysis

2.3.1 響應(yīng)曲面各因素交互作用結(jié)果

響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖3。曲面坡度的平緩與陡峭程度直接反映處理?xiàng)l件發(fā)生的變化對(duì)果汁感官評(píng)定分?jǐn)?shù)的影響程度，如果響應(yīng)面曲面坡度平緩，表明對(duì)于處理?xiàng)l件的變化響應(yīng)值不敏感，反之則為敏感[23-31]。圖3是由響應(yīng)值和各試驗(yàn)因子構(gòu)成的立體曲面圖，顯示了發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接菌量、果汁添加量任意2個(gè)變量取零水平時(shí)其余2個(gè)變量對(duì)果汁感官評(píng)定分?jǐn)?shù)的影響。等高線比較密集說(shuō)明響應(yīng)值（感官評(píng)定分?jǐn)?shù)）在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存在極高值，交互影響作用顯著，與方差分析結(jié)果一致，等高線比較稀疏說(shuō)明交互影響作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖3a是接菌量為3%，果蔬汁添加量為50%時(shí)，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)定分?jǐn)?shù)的交互作用。當(dāng)接菌量與果蔬汁添加量一定時(shí)，隨著發(fā)酵溫度升高，發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)定分?jǐn)?shù)先增大后減小。當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官評(píng)定分?jǐn)?shù)先增大后減小。等高線比較密集，說(shuō)明響應(yīng)值（感官評(píng)定分?jǐn)?shù)）在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存在極高值，交互影響作用顯著，圖3b和圖3d同理。

圖3f是發(fā)酵溫度為31 ℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，接菌量與果汁添加量對(duì)感官評(píng)定分?jǐn)?shù)的交互作用。當(dāng)果汁添加量一定時(shí)，感官評(píng)定分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時(shí)間的升高先增大后趨于平緩；當(dāng)接菌量一定時(shí)，感官評(píng)定分?jǐn)?shù)隨果汁添加量升高而趨于平緩，表明果蔬汁添加量和接菌量交互作用不大，圖3c和3e同理。

圖3 各因素交交互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 3 Response surface diagram of interaction of various factors

2.3.2 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)得到乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的最佳工藝為：發(fā)酵溫度為31 ℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h，接菌量為3%，果汁添加量為50%。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的感官評(píng)分實(shí)測(cè)值為80.33分，與預(yù)測(cè)值比較近，說(shuō)明該模型可行性較高，可作為實(shí)際生產(chǎn)的依據(jù)。

2.4 菌落總數(shù)結(jié)果

菌落平板計(jì)數(shù)法是基于每一個(gè)分散的活細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中具有生長(zhǎng)繁殖并能形成一個(gè)菌落的能力。將發(fā)酵復(fù)合果蔬汁經(jīng)10 倍系列稀釋后，將一定濃度的稀釋液定量地接種到瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落總數(shù)。菌落總數(shù)結(jié)果如圖4所示，稀釋倍數(shù)為108時(shí)菌落數(shù)為256，稀釋倍數(shù)為109時(shí)菌落數(shù)為25，計(jì)算得知樣品中菌落總數(shù)為2.56×1010CFU/mL。

圖4 菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Figure 4 Determination results of total number of colonies

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)價(jià)法探究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接菌量和果汁添加量對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁感官的影響。各因素對(duì)感官評(píng)定影響大小順序?yàn)榻泳浚竟砑恿浚景l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化獲得的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h、接菌量3%、果汁添加量50%，此時(shí)感官評(píng)定分?jǐn)?shù)最高80.33，樣品中的菌落數(shù)達(dá)到2.56×1010CFU/mL，表明可采用模糊感官綜合評(píng)價(jià)與響應(yīng)面優(yōu)化法相結(jié)合優(yōu)化復(fù)合果蔬汁工藝。該產(chǎn)品飲料色澤鮮艷、風(fēng)味良好、口感協(xié)調(diào)，本研究為果蔬汁的開(kāi)發(fā)利用途徑提供了參考依據(jù)。