紅樹(shù)老鼠簕來(lái)源真菌Talaromyces flavus TGGP35次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抗氧化活性

蔡 瑾，羅運(yùn)展，劉 婧，張學(xué)龍，肖 媚，韋方芳，張子怡，鄭彩娟*

（1.海南師范大學(xué) 熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158；2.海南師范大學(xué) 海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158）

紅樹(shù)來(lái)源的真菌由于其宿主生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性（高鹽、高溫、高壓、強(qiáng)光照等）具有獨(dú)特的代謝機(jī)制，能夠代謝出結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的化學(xué)成分[1-2]。因此，紅樹(shù)來(lái)源真菌是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要資源[3]。Talaromyces屬真菌可以代謝出結(jié)構(gòu)新穎且生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16 細(xì)胞）具有細(xì)胞毒活性的十氫化萘衍生物fusarielins O-P[4]和氧雜萘酮二聚體衍生物talaverrucin A[5]、具有顯著α-葡萄糖苷酶抑制活性的含硫酯苯甲酸酯衍生物eurothiocins C-H[6]、抗炎活性的環(huán)戊酮類(lèi)化合物talarocyclopenta A 和衣康酸類(lèi)化合物talarocyclopentas B-C[7]等。為從Talaromyces屬中分離獲得更多生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，本研究從一株來(lái)源于藥用紅樹(shù)老鼠簕的內(nèi)生真菌T.flavusTGGP35中分離得到7個(gè)化合物（1-7），結(jié)構(gòu)分別鑒定為：physcion（1）、paeciloxanthone（2）、5-[（3E，5E）-3，5-nonadienyl]-1，3-benzenediol（3）、trans-ferulic acid（4）、3，4-二甲氧基甲苯（5）、對(duì)羥基苯甲醛（6）和對(duì)羥基苯乙酮（7）?；衔?-7的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1-7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures of compounds 1-7

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GAA076 LC質(zhì)譜儀，瑞士Bruker公司；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；EYELAN-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化有限公司；YOKO-ZK 紫外分析暗，武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；Sephadex LH-20 凝膠，Amersham Blosclences 公司；Bruker AV-400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀，瑞士Bruker 公司；恒溫水浴鍋B-220，上海亞榮生化儀器廠；薄層硅膠GF254和柱色譜硅膠，青島海洋化工廠，總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法），海南科貿(mào)生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中所使用的化學(xué)試劑均來(lái)自廣州西隴化工股份有限公司。

1.2 菌株的分離與篩選

1.2.1 菌株來(lái)源

從藥用紅樹(shù)老鼠簕（A.ilicifoliusL.）的莖中分離、鑒定、篩選出一株命名為T(mén)GGP35 的菌株。通過(guò)18S rRNA擴(kuò)增和ITS區(qū)域測(cè)序，結(jié)合真菌的形態(tài)特征將該真菌鑒定為T(mén).flavus；該序列數(shù)據(jù)已提交給GenBank，登錄號(hào)為MT071116。該菌種現(xiàn)保存于海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（PDA培養(yǎng)基，4 ℃保存）。

1.2.2 菌株的培養(yǎng)

菌株T.flavusTGGP35 經(jīng)過(guò)活化后，分別接種到裝有400 mL 馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）的2 個(gè)1L 錐形瓶中，恒溫（28 ℃）振蕩培養(yǎng)72 h以獲得種子培養(yǎng)液。然后將種子培養(yǎng)液分別轉(zhuǎn)移到裝有200 mL PDB 培養(yǎng)基的50個(gè)1L錐形瓶PDB中，室溫靜置發(fā)酵30 d。

1.3 提取與分離

液體發(fā)酵產(chǎn)物采用乙酸乙酯萃取3次（萃取體積比1∶2），減壓濃縮后得到總質(zhì)量為10.6 g的初始浸膏。隨后將浸膏通過(guò)正相硅膠柱（150～75 μm）梯度洗脫，用石油醚/EtOAc（V/V，梯度100∶0 →0∶100）和EtOAc/MeOH（V/V，梯度100∶0 →0∶100）作為洗脫劑，每瓶200 mL進(jìn)行收集，最終經(jīng)TLC分析、合并相同流分后得到7個(gè)組分（Fr.A-Fr.G）。組分Fr.B（1.5 g）采用正相硅膠柱（75～48 μm）層析，通過(guò)石油醚/EtOAc（9∶0→1∶1）的梯度進(jìn)行洗脫分離，通過(guò)TLC分析合并為3個(gè)組分（Fr.B1-Fr.B3）。Fr.B2（0.8 g）進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱層析（V/V，石油醚-CHCl3-MeOH，2∶1∶1），然后經(jīng)HPLC分析制備，得到化合物1（10.4 mg）、2（7.3 mg）和4（8.7 mg）。Fr.D（2.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析（CHCl3–MeOH，1∶1，V/V），得到5個(gè)組分（Fr.D1-Fr.D5）。Fr.D3（1.0 g）經(jīng)正相硅膠（75～48 μm）梯度洗脫后[石油醚/EtOAc（8∶1 →0∶1）]，通過(guò)HPLC半制備純化，得到化合物3（8.5 mg）和5（11.7 mg）。組分Fr.E（1.1 g）用正相柱硅膠柱（75～48 μm）梯度洗脫石油醚/EtOAc（V/V，梯度5∶1 →0∶1），得到3個(gè)組分（Fr.E1-Fr.E3）。Fr.E2（0.5 g）進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱層析和HPLC分析制備，得到化合物6（11.4 mg）和7（10.2 mg）。

1.4 抗氧化活性測(cè)試

采用ABTS方法[8]對(duì)化合物1～7進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試。PBS緩沖液作為空白對(duì)照，二甲基亞砜DMSO為陰性對(duì)照，trolox 為陽(yáng)性對(duì)照；使用全波長(zhǎng)功能酶標(biāo)儀測(cè)試樣品在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度A，每組樣品設(shè)置3組平行對(duì)照。根據(jù)公式計(jì)算各樣品的抑制率：抑制率=[（A空白-A樣品）/A空白]×100%，再通過(guò)SPSS軟件計(jì)算出IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末狀固體。陽(yáng)離子ESI-MS 在m/z285.4 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，確定分子量為284.0，結(jié)合1H和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C16H12O5，不飽和度為11。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δH13.50（1H，s，8-OH），7.60（1H，s，H-4），7.35（1H，d，J= 2.4 Hz，H-5），7.11（1H，s，H-2），6.72（1H，d，J= 2.4 Hz，H-7），3.92（3H，s，H-16），2.42（3H，s，H-15）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δC185.7（C，C-9），182.6（C，C-10），166.7（C，C-6），165.3（C，C-8），162.8（C，C-1），148.6（C，C-3），136.7（C，C-14），132.1（C，C-11），124.0（CH，C-2），121.5（CH，C-4），113.5（C，C-12），110.9（C，C-13），108.5（CH，C-5），105.1（CH，C-7），56.1（-OCH3，C-16），21.3（CH3，C-15）。根據(jù)其1H和13C NMR數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[9]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物1為physcion。

化合物2：黃色油狀液體。陽(yáng)離子ESI-MS 在m/z325.2 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M + H]+，確定分子量為324.0，結(jié)合1H和13C NMR波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C20H20O4，不飽和度為13。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH12.54（1H，s，1-OH），7.46（1H，d，J=8.0 Hz，H-3），7.30（1H，s，H-5），7.17（1H，s，H-7），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，H-2），5.32（1H，t，J=7.2 Hz，H-14），4.95（2H，t，J=7.2 Hz，H-11），4.44（1H，t，J=7.2 Hz，11-OH），3.51（2H，d，J=7.2 Hz，H-13），2.51（3H，s，H-12），1.81（3H，s，H-17），1.78（3H，s，H-16）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc184.6（C，C-9），160.1（C，C-1），158.2（C，C-10a），153.0（C，C-4a），147.4（C，C-6），142.7（C，C-8），137.2（CH，C-3），133.5（CH，C-15），127.3（CH，C-7），121.8（CH，C-14），119.2（C，C-4），118.1（CH，C-5），116.7（C，C-8a），110.3（CH，C-2），109.5（C，C-9a），65.4（CH2，C-11），27.6（CH2，C-13），25.9（CH3，C-16），22.1（CH3，C-12），18.1（CH3，C-17）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[10]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物2為paeciloxanthone。

化合物3：白色粉末狀固體。陽(yáng)離子ESI-MS 在m/z233.5 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，確定分子量為232.0，結(jié)合1H 和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C15H20O2，不飽和度為6。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH6.91（1H，t，J=2.4 Hz，H-2），6.76（1H，d，J=2.4 Hz，H-4），6.76（1H，d，J=2.4 Hz，H-6），6.12（1H，dd，J=14.8，6.4 Hz，H-10），6.02（1H，dd，J=14.8，10.4 Hz，H-10），5.73（1H，dt，J=14.8，6.4 Hz，H-9），5.53（2H，dt，J=14.8，7.0 Hz，H-13），2.72（2H，m，H-7），2.47（2H，m，H-8），1.94（2H，m，H-13），1.34（2H，m，H-14），0.83（3H，t，J= 7.0，H-15）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc156.8（C，C-1），156.8（C，C-3），145.2（C，C-5），133.1（CH，C-12），131.2（CH，C-9），131.0（CH，C-11），130.4（CH，C-10），108.2（CH，C-4），108.2（CH，C-6），100.5（CH，C-2），35.9（CH2，C-13），22.7（CH2，C-14），13.9（CH3，C-15）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[11]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物3為5-[（3E，5E）-3，5-nonadienyl]-1，3-benzenediol。

化合物4：白色粉末狀固體。陰離子ESI-MS 在m/z193.3 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，確定分子量為194.0，結(jié)合1H 和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C10H10O4，不飽和度為6。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400MHz，DMSO-d6）:δH7.47（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），7.31（1H，d，J=12.6 Hz，H-8），7.33（1H，s，H-5），7.26（1H，d，J= 7.5 Hz，H-2），6.42（1H，d，J= 8.1 Hz，H-3），3.81（3H，s，H-10）;13C NMR（100 MHz ，DMSO-d6）:δc168.3（C，C-9），149.0（C，C-1），147.9（C，C-6），144.0（CH，C-7），125.9（CH，C-8），122.7（CH，C-4），116.3（CH，C-2），115.6（CH，C-5），111.2（C，C-3），55.7（CH3，C-10）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[12]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物4為trans-ferulic acid。

化合物5：白色粉末狀固體。陰離子ESI-MS 在m/z151.7 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，確定分子量為152.0，結(jié)合1H 和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C9H12O2，不飽和度為4。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH7.59（1H，dd，J= 8.4，2.4 Hz，H-2），7.53（1H，d，J= 2.4 Hz，H-5），6.90（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），3.75（3H，s，H-7），3.83（3H，s，H-8），2.63（3H，s，H-9）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc149.6（C，C-3），149.5（C，C-4），131.4（C，C-1），123.4（CH，C-6），110.3（CH，C-5），110.1（CH，C-2），56.2（CH3，C-7），56.1（CH3，C-8），26.4（CH3，C-9）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[13]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物5為3，4-二甲氧基甲苯。

化合物6：白色粉末狀固體。陽(yáng)離子ESI-MS 在m/z137.3 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，確定分子量為136.0，結(jié)合1H 和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C8H8O2，不飽和度為5。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）:δH7.69（2H，d，J=6.4 Hz，H-3，5），6.13（2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6），2.46（3H，s，H-9）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δc195.9（C，C-7），162.7（C，C-4），130.7（CH，C-6），130.2（CH，C-2），115.5（CH，C-5），115.4（CH，C-3），26.2（CH3，C-8）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[14]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物6為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物7：白色粉末狀固體。陰離子ESI-MS 在m/z121.6 處給出準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，確定分子量為122，結(jié)合1H 和13C NMR 波譜數(shù)據(jù)，推斷其相對(duì)分子式為C7H16N2O2，不飽和度為4。核磁波譜數(shù)據(jù)：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH9.82（1H，s，H-7），7.81（2H，d，J=7.2 Hz，H-3，5），6.37（2H，d，J=7.8 Hz，H-2，6）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δc190.6（C，C-7），164.3（C，C-4），132.7（CH，C-2，6），129.5（C，C-1）。根據(jù)其1H和13C NMR并與文獻(xiàn)[14]報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物7為對(duì)羥基苯乙酮。

2.2 抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)化合物1～7 進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)試，結(jié)果表明化合物6 具有顯著的抗氧化抑制作用，且IC50為0.12 mmol/L 強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥trolox（IC50=0.23 mmol/L），其余化合物在質(zhì)量濃度為1mg/mL 時(shí)均無(wú)明顯的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文運(yùn)用多種色譜分離手段和波譜學(xué)方法，從一株老鼠簕（A.ilicifoliusL.）來(lái)源真菌T.flavusTGGP35中分離鑒定了7個(gè)已知化合物，包括1個(gè)蒽醌類(lèi)化合物（1）、1個(gè)呫噸酮類(lèi)化合物（2）、5個(gè)苯衍生物（3～7）?；钚詼y(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物6（對(duì)羥基苯甲醛）具有顯著的抗氧化活性，其IC50值為0.12 mmol/L（強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照trolox IC50=0.23 mmol/L）。本研究從紅樹(shù)來(lái)源的Talaromyces屬真菌中分離獲得了具有抗氧化活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為抗氧化劑的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。