復合酶對草莓出汁率和澄清度的影響

陳佳楠，馮敏，張超，徐保國*，周存山，馬海樂

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學食品物理加工研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

草莓顏色鮮艷、柔軟多汁，富含對健康有益的活性成分（維生素、礦物質、酚、類黃酮等），素有“漿果皇后”的美稱[1]。新鮮草莓的水分含量達90%以上，且極易腐爛變質，將草莓加工成草莓汁是一種有潛力的草莓深加工形式。

酶處理廣泛應用于果汁制造，以提高果汁產量并降低果汁黏度，從而改善管路輸送，過濾和包裝，從工業(yè)和加工角度來看十分重要[2]。此外，酶通常用于漿果類果汁生產，酶處理所得的果汁可以通過離心或過濾得到清汁。澄清后，果汁的澄清度、香氣和風味等均增加[3]。酶解技術具有分解果肉細胞物質的能力，不同種類的酶制劑在果汁處理過程中具有特異性作用。常用于果汁加工的酶制劑有果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等，均可降解形成細胞壁網(wǎng)絡的多糖，釋放果汁和糖苷結合的化合物[4]。果膠酶是一類水解酶，可催化果膠中α-1，4-糖苷鍵的裂解，生成聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸等[5]；而纖維素酶催化纖維素鏈中α-1，4鍵的水解，產生低聚糖、纖維素二糖和葡萄糖[6]。單一酶加入的酶解效果往往具有局限性，而復合酶之間的協(xié)同作用可以彌補這一缺陷[7-9]。因此，本文旨在探究適合草莓酶解的復合酶和酶解條件，以提高草莓的出汁率和澄清度，為開發(fā)草莓汁工藝研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅顏草莓（Fragaria×ananassa Duch.）購自江蘇省丹陽市草莓農場，選擇大小和顏色均勻且無機械損傷的成熟草莓作為試驗對象，儲存于4℃的冰箱中備用；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）、木聚糖酶（10 000 U/g）：上海麥克林生物科技有限公司；抗壞血酸：鎮(zhèn)江國藥集團化學試劑公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

WBL2501B型料理機：廣東美的生活電器制造有限公司；DL-5C型冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；CPA1003P型電子天平：德國賽多利斯集團；PHS-3C型pH計、WAY-2S型阿貝折光儀：上海精密科學儀器有限公司；DDS-11AT數(shù)字電導率儀：上海雷磁新涇儀器有限公司；T6新世紀型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 草莓的品質特性測定

在室溫（20℃）下，采用pH計測定草莓打漿后的pH值；水分含量參照王旭樂[10]的干燥法；可溶性固形物采用阿貝折光儀進行測定[11]，以白利糖度（°Brix）為單位表示；電導率用電導率儀測定[12]，以ms/cm為單位表示；可滴定酸采用NaOH滴定法測定[13]；還原性糖采用蒽酮-硫酸顯色法測定[14]。

1.3.2 草莓汁的制備

取適量的草莓，去除花萼和果梗、洗凈表面雜質、瀝干并切成小塊，按料液比2∶1（g/mL）加水打漿，并加入0.05%抗壞血酸護色，再加入一定量的果膠酶和纖維素酶，攪拌均勻，然后將其放入水浴鍋中進行酶解反應，酶解結束后迅速用冷水降到室溫（20℃），8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)兩層紗布過濾，得到草莓汁。

1.3.3 草莓汁出汁率的測定

參照Bora等[15]的方法測定出汁率，計算公式如下。

1.3.4 草莓汁澄清度的測定

在660 nm處測量果汁的透光率，以透光率T（%）表示果汁的澄清度[16]。

1.3.5 酶解單因素試驗設計

選擇果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶3種不同的酶制劑并且兩兩復合，在酶解溫度25℃、酶解時間30 min，固定酶添加量為0.12%的初始酶解條件基礎上，研究酶制劑對草莓汁出汁率和澄清度的影響，找出最適酶制劑進行復合。

分別以復合酶質量比（1∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、2 ∶3、3∶2）、復合酶添加量（0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%）、酶解溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）、酶解時間（20、25、30、35、40、45 min）進行單因素試驗，考察各指標對草莓出汁率和澄清度的影響。

1.3.6 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取復合酶添加量（A）、復合酶質量比（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，以草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）為響應值，設計四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，編碼水平見表1。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平Table 1 Factors and levels in the optimization test by response surface methodology

1.3.7 感官評價

參考GB/T 10221—2021《感官分析 術語》、李雨浩[17]和Laaksonen等[18]的方法，使用九點快感標度法評估草莓汁樣品的感官特性。由20名（10男10女）經(jīng)過培訓的評價員，根據(jù)草莓汁的感官特征分別從9個感官指標進行評分，每個指標按強度分級，從0～10分進行打分，具體評價標準見表2。

表2 草莓汁的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of strawberry juice

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

每組試驗進行3次，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。比較組間的單因素方差和鄧肯分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。使用Origin 2021作圖，描繪各試驗數(shù)據(jù)的變化情況。采用Design-Expert 11軟件進行響應面試驗設計與結果分析。

2 結果與分析

2.1 草莓的品質特性分析

本試驗所采用的草莓原料的品質特性分析見表3。

表3 草莓的品質特性Table 3 Quality characteristics of strawberries

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 不同酶制劑對草莓出汁率和澄清度的影響

不同酶制劑對草莓出汁率和澄清度的影響見圖1。

圖1 不同酶制劑對草莓出汁率和澄清度的影響Fig.1 Effects of different enzyme preparations on strawberry juice yield and clarity

由圖1可知，在單一酶中果膠酶的出汁率最高，其次是纖維素酶和木聚糖酶，果膠酶的酶解效果比纖維素酶更好，主要是因為在草莓果肉中，果膠含量比纖維素高。因此，果膠的降解對于從細胞中釋放果汁更為重要。復合酶的酶解效果明顯高于單一酶解，其中果膠酶和纖維素酶復合后，出汁率最高，從對照組的64.16%提高到87.38%。與對照組相比，果膠酶處理的澄清度顯著升高（p＜0.05），其他單一酶的效果并不顯著（p＞0.05）。果膠酶和纖維素酶復合的澄清度最高，從對照組的2.34%提高到72.83%。在香蕉汁中，Bora等[15]通過果膠酶和纖維素酶聯(lián)合處理來改善澄清度。綜合考慮不同酶制劑對出汁率和澄清度的影響，最終選擇果膠酶和纖維素酶進行復合，以實現(xiàn)對細胞壁化合物的最大分解。

2.2.2 復合酶質量比對草莓出汁率和澄清度的影響

復合酶質量比對草莓出汁率和澄清度的影響見圖2。

圖2 復合酶比例對草莓出汁率和澄清度的影響Fig.2 Effect of ratio of complex enzymes on strawberry juice yield and clarity

由圖2可知，當果膠酶與纖維素酶質量比為3∶1時，草莓出汁率最高，為90.31%。由于果膠酶比纖維素酶在增加草莓出汁率方面更有效，草莓出汁率隨著果膠酶占比的增加而呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，當果膠酶占比過高時，又不足以破壞草莓細胞壁中的纖維素結構，導致出汁率低。草莓汁的澄清度也隨著復合酶質量比的不同而變化，質量比為3∶1時，草莓汁的澄清度為88.39%，顯著高于其他復合酶質量比的澄清度（p＜0.05），澄清度主要受果膠的影響較大，因此綜合考慮，選取2∶1、3∶1、4∶1為響應面試驗的3個水平。

2.2.3 復合酶添加量對草莓出汁率和澄清度的影響

復合酶添加量對草莓出汁率和澄清度的影響見圖3。

圖3 酶添加量對草莓出汁率和澄清度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition amount on strawberry juice yield and clarity

由圖3可知，隨著復合酶添加量的增加，草莓的出汁率和澄清度先增加后降低。在復合酶添加量為0.16%時，草莓出汁率最高，為89.09%，顯著高于其他復合酶添加量（p＜0.05）；當添加量為0.20%時，草莓汁的澄清度達到最大，為90.66%。當復合酶添加量過低時，酶促反應不足，草莓中的果膠無法完全分解，而當復合酶添加量過高時，由于草莓汁的pH值太低，未反應的酶會形成酶蛋白沉淀[19]，這些都會導致草莓出汁率低、澄清度差。因此選取0.12%、0.16%、0.20%為響應面試驗的3個水平。

2.2.4 酶解溫度對草莓出汁率和澄清度的影響

酶解溫度對草莓出汁率和澄清度的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對草莓出汁率和澄清度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on strawberry juice yield and clarity

由圖4可知，在酶解溫度為25℃～45℃時，草莓的出汁率隨著酶解溫度的升高而顯著上升（p＜0.05），當溫度達到45℃后出汁率開始下降，45℃時出汁率為最高值90.51%。可見溫度對酶活性有一定影響，溫度過低或過高均會影響酶活力，從而導致酶解能力下降。酶解溫度為30℃時，澄清度最高，為78.88%。隨后呈緩慢下降的趨勢，這與溫度升高導致的草莓可溶性固形物含量增加有密切關系，而且溫度升高會引起絮凝沉淀物的部分重新溶解[20]，從而透光率降低。綜合考慮草莓汁在較高溫度下酶解，會影響草莓品質，因此選擇35、40、45℃為響應面試驗的3個水平。

2.2.5 酶解時間對草莓出汁率和澄清度的影響

酶解時間對草莓出汁率和澄清度的影響見圖5。

圖5 酶解時間對草莓出汁率和澄清度的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on strawberry juice yield and clarity

由圖5可知，20 min～35 min時，隨著酶解時間的延長，草莓出汁率迅速升高，35 min后逐漸趨于平穩(wěn)并逐漸下降。酶解35 min時，草莓出汁率最高，為89.66%。但在 35 min～40 min 時，出汁率無顯著變化（p＞0.05）。草莓的澄清度呈先降低后升高又降低的趨勢，所以酶解時間過長會造成草莓澄清度降低，營養(yǎng)成分也可能損失。綜合考慮草莓汁的酶解時間越長，越容易造成氧化褐變，因此選擇20、30、40 min為響應面試驗的3個水平。

2.3 草莓酶解工藝優(yōu)化試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取復合酶添加量、復合酶質量比、酶解溫度、酶解時間為自變量，以草莓出汁率和澄清度為響應值，設計四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，試驗結果見表4。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results for response surface methodology

續(xù)表4 響應面試驗設計與結果Continue table 4 Design and results for response surface methodology

應用Design-Expert 11軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）與復合酶添加量（A）、復合酶質量比（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）之間的二次多項式回歸方程如下。

2.3.2 響應面方差分析

對草莓出汁率和澄清度的方差分析結果見表5和表6。

表5 草莓出汁率的方差分析結果Table 5 Variance analysis results of strawberry juice yield

表6 草莓汁澄清度的方差分析結果Table 6 Variance analysis results of strawberry juice clarity

由表5和表6可知，兩個模型的p＜0.000 1，說明回歸方程極顯著，失擬項的p＞0.05表明差異不顯著，說明模型擬合度較好，試驗誤差較小。由方差分析p結果可知，在影響草莓出汁率的各項因素中，B、CD、B2對草莓出汁率的影響顯著；A、C、D、AD、A2、C2、D2對草莓出汁率的影響極顯著；其余因素均對草莓出汁率不顯著。在影響草莓汁澄清度的各項因素中，A、BC對草莓汁澄清度的影響顯著；B、C、D、BD、CD、A2、B2、C2、D2對草莓汁澄清度的影響極顯著；其余因素均對草莓汁澄清度不顯著。根據(jù)F值的大小得出各因素對出汁率的影響順序為酶解溫度＞酶解時間＞復合酶添加量＞復合酶質量比，對澄清度的影響順序為酶解時間＞復合酶質量比＞酶解溫度＞復合酶添加量。

2.3.3 響應曲面分析

各因素之間的交互作用對草莓出汁率和澄清度的等高線圖和三維響應面圖見圖6和圖7。

圖6 各因素對草莓出汁率交互作用的等高線圖和三維響應面圖Fig.6 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice yield

圖7 各因素對草莓澄清度交互作用的等高線圖和三維響應面圖Fig.7 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice clarity

從圖6和圖7中的橢圓形狀可以看出各因素交互作用的強弱，越接近橢圓表示交互作用越顯著，若呈現(xiàn)圓形則交互作用不顯著；三維響應面圖的坡度越陡峭，說明因素對響應值的影響越大[21]。綜合各因素對草莓出汁率和澄清度的綜合影響，通過軟件分析對兩個回歸方程進行極大值求解，得到最佳酶解條件為復合酶添加量為0.17%、復合酶質量比為3.27∶1、酶解溫度為41.03℃、酶解時間為34.02 min，此條件下草莓出汁率的預測值為90.72%，澄清度的預測值為84.79%。根據(jù)實際情況，將酶解條件修正為復合酶添加量0.17%、復合酶質量比3∶1、酶解溫度41℃、酶解時間35 min。

2.3.4 結果優(yōu)化與驗證

為驗證模型預測值的準確性，在上述優(yōu)化條件下進行3次平行試驗，所得草莓出汁率為（90.84±0.45）%，澄清度為（84.61±0.63）%，試驗結果與模型方程的理論值基本吻合，進一步證明模型的可靠性。

2.4 感官評價分析

4種不同酶酶解的草莓汁的感官評分見表7。

表7 草莓汁的感官評分Table 7 Sensory scores of strawberry juice

由表7可知，未經(jīng)酶處理（對照組）的草莓汁與酶處理組有很大不同，對照組的草莓汁澄清度較差、酸味較大、苦味較小、風味較弱。果汁具有大部分的酸和甜的特性，而澀味主要是來自果皮部分和大量的酚類化合物，果膠能結合多酚類物質，從而降低對澀味的感知[22]，所以果膠酶的加入可能同時增加澀味。還有研究發(fā)現(xiàn)酶處理是果汁香氣改變的主要原因，而短期熱處理不會影響果汁氣味[23]。在本研究中，不同酶酶解的草莓汁的澀味和氣味無顯著差異（p＞0.05）。與對照組相比，不同酶酶解的草莓汁的綜合評分呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），綜合來看，纖維素酶酶解后具備較好的甜味，果膠酶酶解后色澤、澄清度更高，澀味、氣味沒有顯著性差異，復合酶綜合了兩種酶的優(yōu)點，綜合評分相對最高，為7.36±1.12，整體風味及口感更優(yōu)。

3 結論

本研究通過單因素試驗確定了草莓汁酶解工藝中復合酶的種類，與單一的酶制劑相比，復合酶明顯提高了草莓的出汁率和澄清度，通過響應面優(yōu)化，確定復合酶最佳酶解條件為復合酶添加量為0.17%、復合酶（果膠酶與纖維素酶）質量比為3∶1、酶解溫度為41℃、酶解時間為35 min，此條件下草莓出汁率為90.84%，澄清度為84.61%。與優(yōu)化前相比，出汁率和澄清度分別提高了6.93%和32.20%。使用九點快感標度法評估草莓汁的感官特性，結果表明復合酶的感官評分最高，整體風味及口感更優(yōu)。