乳清分離蛋白-蘋果果膠協(xié)同穩(wěn)定百里香精油Pickering乳液的制備及其抑菌保鮮性能研究

劉珍珍，辛穎*，張家豪，楊晨浩，劉昆侖*

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.鄭州旅游職業(yè)學院烹飪食品學院，河南 鄭州 450009）

精油被認為是芳香性植物的次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗菌、抗病毒和抗氧化能力[1-2]。其中，百里香精油（thyme essential oil，TEO）作為一種廣譜抗菌劑和強抗氧化劑在果蔬涂膜保鮮中受到廣泛關注[3-6]。然而，由于其是一種穩(wěn)定性較差的油性液體，不僅遇光、遇氧或加熱后容易揮發(fā)或分解，而且氣味刺鼻、溶解度低、釋放快，大大限制了其作為抑菌活性物質(zhì)在果蔬保鮮方面的應用。為了克服TEO的易感性，對其進行封裝緩釋一直是研究熱點。Pickering乳液作為一種由膠體顆粒穩(wěn)定的乳狀液，比表面活性劑穩(wěn)定體系具有更高的抗揮發(fā)性，這意味著膠體顆粒穩(wěn)定的精油Pickering乳液體系應用于果蔬保鮮時，具有更長的緩釋作用[7-9]，可進一步延長貨架期。

目前，用于穩(wěn)定Pickering乳液體系的膠體顆粒種類繁多，蛋白質(zhì)-多糖復合體系因在改善顆粒表面活性方面存在協(xié)同效應而得以廣泛研究[10-11]。乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）具有突出的營養(yǎng)價值和理化性質(zhì)，蘋果果膠（apple pectin，AP）是一種陰離子多糖，在特定pH值范圍內(nèi)兩者能夠攜帶相反電荷而產(chǎn)生靜電絡合作用，形成蛋白質(zhì)-多糖復合納米顆粒，用于Pickering乳液的制備，但靜電復合物具有較高的環(huán)境敏感性，導致其在涂膜保鮮中的應用受到極大的限制。已有研究表明，通過熱誘導的方法能夠制備出相對穩(wěn)定的食品級蛋白質(zhì)-多糖復合納米顆粒[12-14]。因此，本研究采用熱誘導法制備WPI-AP復合納米顆粒穩(wěn)定的負載TEO Pickering乳液，系統(tǒng)研究WPI與AP質(zhì)量比、顆粒濃度、熱改性溫度以及超聲強度對其包埋率和體系穩(wěn)定性的影響，同時通過抑菌圈（diameter of inhibition zone，DIZ）、最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和鮮切蘋果涂膜保鮮試驗對其抑菌保鮮性能進行評價，為該乳液在鮮切果蔬涂膜保鮮中的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香精油：吉安市中香天然植物有限公司；乳清分離蛋白（食品級）：恒天然合作社集團有限公司；蘋果果膠（食品級）：寧波鼎元食品科技有限公司；冰乙酸、氫氧化鈉、正己烷、丙三醇（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；無水乙酸鈉（分析純）、瓊脂粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯：北京奧博星生物技術有限責任公司；紅富士蘋果：市售。

1.2 儀器與設備

pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；高速剪切分散乳化機（F18）：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；超聲波細胞粉碎機（JY92-IIN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；激光粒度分析儀（BT-9300ST）：丹東百特儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（FJS-6）：上海維誠儀器有限公司；色彩色差儀（CR-400）：柯尼卡美能達辦公系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Pickering乳液制備的單因素試驗

1.3.1.1 WPI與AP質(zhì)量比對Pickering乳液性質(zhì)的影響

分別稱取一定質(zhì)量的WPI和AP溶于10 mmol/L、pH4.5的醋酸緩沖液中，使WPI和AP質(zhì)量比分別為3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3，磁力攪拌 12 h，使其充分溶解，得到質(zhì)量濃度為1.5%的WPI-AP懸浮液。調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，80℃水浴加熱15 min，立即采用冰浴冷卻至25℃，即可得到WPI-AP復合納米顆粒。向制得的納米顆粒分散體系中，加入20%TEO，13 500 r/min剪切30 s制得粗乳液，然后在超聲強度4.35 W/cm2條件下，使用超聲波細胞破碎儀制備Pickering乳液。

1.3.1.2 納米顆粒質(zhì)量濃度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

在WPI與AP質(zhì)量比1∶2的條件下，配制質(zhì)量濃度分別為 0.9%、1.5%、2.1%、2.7%、3.3%的 WPI-AP懸浮液，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，然后在熱改性溫度80℃以及超聲強度4.35 W/cm2條件下，進行Pickering乳液的制備。

1.3.1.3 熱改性溫度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

在WPI與AP質(zhì)量比1∶2的條件下，配制質(zhì)量濃度為2.7%的WPI-AP懸浮液，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，然后控制熱改性溫度分別為 75、80、85、90、95 ℃，超聲強度4.35 W/cm2條件下進行Pickering乳液的制備。

1.3.1.4 超聲強度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

固定WPI與AP質(zhì)量比1∶2，顆粒質(zhì)量濃度為2.7%，熱改性溫度80℃，分別在超聲強度3.00、4.35、5.70、7.05、8.40 W/cm2條件下，使用超聲波細胞破碎儀制備Pickering乳液。

1.3.2 Pickering乳液包埋率的測定

參照吳子涵等[15]的方法，并稍作修改。取1 mL Pickering乳液，加入5 mL正己烷，漩渦振蕩20 s，5 000 r/min離心10 min，離心后上清液稀釋100倍，274 nm處測定吸光度，通過標準曲線與下列公式計算乳液包埋率。

1.3.3 乳液粒徑及多分散性的測定

采用激光粒度分析儀測定Pickering乳液的平均粒徑及多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。儀器參數(shù)：折射率1.450，測試溫度25℃，平衡時間30 s，每個樣品測試3次。

1.3.4 負載TEO Pickering乳液抑菌性能考察

1.3.4.1 抑菌圈（DIZ）的測定

分別取108CFU/mL的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌菌液各100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，待菌液吸收后用孔徑6 mm的打孔器在瓊脂平板上打孔。以無菌水為空白對照，向孔內(nèi)加入一定體積過濾除菌的TEO和乳液（控制乳液中精油含量與純精油含量一致）。水平放置于4℃冰箱中，待樣品完全擴散后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束，用十字交叉法測量各抑菌圈直徑。每個菌種均重復試驗3次，取平均值。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定

將一系列不同濃度的TEO Pickering乳液與100μL、濃度為108CFU/mL的菌懸液25℃混勻，然后將其均勻涂布于營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，以不加乳液作空白對照，置于37℃生物培養(yǎng)柜中培養(yǎng)24 h。以不生長菌樣品的最低濃度作為TEO Pickering乳液對該菌的MIC值。每個菌種測試至少重復3次，取其平均值。

1.3.5 負載百里香精油Pickering乳液的涂膜液對鮮切蘋果的保鮮試驗

1.3.5.1 涂膜液的制備

用電子天平精確稱取一定質(zhì)量的WPI粉末，加入蒸餾水使其溶解，放在磁力攪拌器上攪拌均勻，制得10.5%的WPI溶液。然后在數(shù)顯恒溫水浴鍋內(nèi)90℃下攪拌30 min，取出冷卻后加入60%的甘油再攪拌均勻，即得WPI涂膜液。而后加入0.5%的負載TEO Pickering乳液，磁力攪拌15 min，13 500 r/min高速剪切5 min，得到WPI-TEO Pickering乳液復合涂膜液。

1.3.5.2 鮮切蘋果涂膜處理

在市場挑選大小、色澤接近且無損傷的“煙臺紅富士”蘋果，然后在4℃冰箱中預冷24 h，先將蘋果表面用清水清洗干凈，然后在200 μL/L的次氯酸鈉溶液中浸泡滅菌2 min，再用蒸餾水洗滌并在25℃下干燥；之后用預先消毒過的刀具去除蘋果的果皮和果核，取與表皮和果核相同距離的中間組織部位，切成1 cm3的方塊，混合均勻。將取樣均勻的蘋果塊隨機分成對照組（CK）、WPI處理組（W）和 WPI-Pickering乳液組（W+P），對照組浸泡在蒸餾水中，另外兩組分別浸泡在對應的涂膜溶液中，均浸泡2 min。涂膜處理的樣品在25℃晾至不再有液體滴落，而后轉移至一次性保鮮盒中25℃下晾干。每組固定取30個蘋果塊測定失重率、腐爛率和色澤變化，每個處理均做3個平行。將處理好的蘋果塊置于8℃條件下儲藏，每隔2 d對蘋果進行取樣測定。

1.3.5.3 腐爛率測定

統(tǒng)計每組蘋果的腐爛情況（菌斑、腐爛、發(fā)黑），腐爛率按照下式計算[16]。

1.3.5.4 失重率測定

失重率按照下式計算[17]。

1.3.5.5 色澤測定

將樣品從貯藏環(huán)境中取出后在25℃下平衡，用色差計測定L*、a*、b*值。每組測定3個果實。鮮切蘋果的色澤指標選擇亮度（L*）和顏色飽和度（C*）進行分析，計算公式如下[18]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0和Origin 2021軟件進行統(tǒng)計分析及作圖，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 WPI與AP質(zhì)量比對Pickering乳液性質(zhì)的影響

WPI與AP質(zhì)量比對Pickering乳液性質(zhì)的影響見圖1。

圖1 WPI與AP質(zhì)量比對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響Fig.1 Effect of WPI and AP ratio on Pickering emulsion embedding rate and average particle size

從圖1可見，隨著AP比例的增多，Pickering乳液的包埋率和平均粒徑呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，這可能是由于AP分子之間會發(fā)生橋接效應，彼此纏繞結合在蛋白質(zhì)的外部，顆粒整體形成一個核殼型結構，進而使復合物在精油表面具有更好的吸附效果和更強的穩(wěn)定性[19-20]。然而，WPI與AP質(zhì)量比為1∶2后，包埋率趨于穩(wěn)定，且PDI較小并趨于穩(wěn)定，這主要是由于在此質(zhì)量比下精油表面空間能夠被吸附的復合粒子已經(jīng)達到極限，此時乳液具有較高的包埋率和較強的體系穩(wěn)定性。因此，選定WPI與AP質(zhì)量比1∶2作為制備Pickering乳液的最佳顆粒配比。

2.1.2 納米顆粒質(zhì)量濃度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

納米顆粒質(zhì)量濃度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響見圖2。

圖2 納米顆粒質(zhì)量濃度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響Fig.2 Effect of mass concentration of nanoparticles on Pickering emulsion embedding rate and average particle size

從圖2可見，隨著顆粒濃度的增加，Pickering乳液的包埋率呈現(xiàn)上升趨勢，這主要是由于更多的顆粒數(shù)量能夠充分將精油包裹起來[21-24]。當濃度達到2.1%后，包埋率趨于穩(wěn)定。而當濃度超過2.7%后，包埋率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于顆粒濃度過高，顆粒分散體流動性變差，導致乳液黏度增大，乳化不完全。另外，顆粒濃度為2.7%時乳液表現(xiàn)出較小的平均粒徑和PDI。因此，選定顆粒濃度2.7%作為制備Pickering乳液的最佳顆粒濃度。

2.1.3 熱改性溫度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

熱改性溫度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響見圖3。

圖3 熱改性溫度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響Fig.3 Effect of thermal modification temperature on Pickering emulsion embedding rate and average particle size

從圖3可見，熱改性溫度從75℃到85℃，Pickering乳液包埋率沒有顯著變化（P＞0.05）。但是在80℃之后包埋率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于溫度升高，蛋白質(zhì)變性程度增加，進而產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，使得其乳化性和乳化穩(wěn)定性下降[25]。從粒徑結果也可以看出，Pickering乳液在80℃時表現(xiàn)出最小的平均粒徑，80℃之后平均粒徑和PDI出現(xiàn)變大趨勢。因此，選定熱改性溫度80℃作為制備Pickering乳液的最佳熱改性溫度。

2.1.4 超聲強度對Pickering乳液性質(zhì)的影響

超聲強度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響見圖4。

圖4 超聲強度對Pickering乳液包埋率和平均粒徑的影響Fig.4 Effect of ultrasonic intensity on Pickering emulsion embedding rate and average particle size

從圖4可見，隨著超聲強度的增大，Pickering乳液的包埋率呈現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢，而乳液的平均粒徑和PDI呈先下降后上升趨勢。在超聲強度為4.35 W/cm2時，乳液的包埋率為（90.96±1.83）%，與超聲強度3 W/cm2時的結果無顯著性差異（P＞0.05），而在4.35 W/cm2時平均粒徑和PDI出現(xiàn)最小值。這可能是由于超聲強度過大會在一定程度上破壞顆粒的穩(wěn)定性，產(chǎn)生離解現(xiàn)象，使包埋率有所降低[26]。然而，在超聲強度過小的情況下，產(chǎn)生的空化強度不足以使高速剪切后的粗乳液充分細化。因此，選定超聲強度4.35 W/cm2作為制備Pickering乳液的最佳超聲強度。

綜上所述，選定WPI與AP質(zhì)量比1∶2、顆粒質(zhì)量濃度2.7%、熱改性溫度80℃以及超聲強度4.35 W/cm2作為制備具有較高包埋率和良好體系穩(wěn)定性的Pickering乳液的最佳條件。

2.2 負載TEO Pickering乳液抑菌性能測定結果

鮮切果蔬由于失去果皮的保護，表面流出的營養(yǎng)汁液會成為微生物的天然培養(yǎng)基，其中兩大主要微生物類型為致病菌和致腐菌。金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均為能夠引起食物中毒的較常見的食源性致病菌，枯草芽孢桿菌是易引起鮮切果蔬腐敗變質(zhì)的典型致腐菌之一[27-28]。

采用瓊脂擴散法研究游離TEO和其Pickering乳液樣品對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑（DIZ），結果如圖5和表1所示。

圖5 TEO和其乳液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of TEO and its emulsion against Staphylococcus aureus，Listeria monocytogenes and Bacillus subtilis

表1 TEO和其乳液對不同細菌抑菌圈的影響Table 1 Effects of TEO and its emulsion on different bacteriostatic circles

由表1可知，Pickering乳液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的DIZ值分別為（25.17±1.53）、（29.33±3.01）mm 和（26.83±2.75）mm，盡管小于TEO組的DIZ值，但均大于20 mm，說明兩者均具有高度敏感抑菌作用[18]。Pickering乳液的包埋雖然在較短的時間內(nèi)降低了其功能活性，但在存儲期間會釋放增強，這種現(xiàn)象能夠使它們在不同的應用環(huán)境下和更長的時間內(nèi)保持功能活性，例如在食品活性薄膜中的應用[7，29-31]。

采用二倍梯度稀釋法測定TEO Pickering乳液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，結果如圖6所示。

圖6 TEO Pickering乳液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的MIC值測定照片F(xiàn)ig.6 Determination of MIC values of TEO Pickering emulsion against Staphylococcus aureus，Listeria monocytogenes and Bacillus subtilis

由圖6可知，TEO Pickering乳液對金黃色葡萄球菌的MIC值為12.5 μL/mL，而對單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌的MIC值則達到了200 μL/mL和100 μL/mL。結合抑菌圈試驗結果可知，TEO Pickering乳液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果良好。然而，TEO Pickering乳液對單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌雖然具有更敏感的抑菌作用，但MIC值較大。

2.3 負載TEO Pickering乳液的涂膜液對鮮切蘋果的保鮮作用

2.3.1 鮮切蘋果腐爛率的測定結果

由于鮮切果蔬的果肉組織直接與外界接觸，再加上鮮切加工過程中的機械損傷，極易受到微生物的污染發(fā)生腐敗變質(zhì)。不同處理組對鮮切蘋果腐爛率的影響如圖7所示。

圖7 涂膜處理對鮮切蘋果腐爛率的影響Fig.7 Effect of coating treatment on decayed rate of fresh-cut apple

由圖7可知，在儲藏期間的前4 d內(nèi)，各處理組均未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。從第4天開始，CK組和W組腐爛率均出現(xiàn)急劇上升趨勢。在第8天時CK組和W組腐爛率分別達到了（92.22±1.92）%和（73.33±6.67）%。然而，W+P組的鮮切蘋果在整個儲藏期間幾乎未發(fā)生腐爛現(xiàn)象。

2.3.2 鮮切蘋果失重率的測定結果

儲藏過程中，鮮切蘋果由于果實組織的蒸騰作用使水分減少，造成質(zhì)量損失，失重率是評價鮮切果蔬品質(zhì)的一個重要指標。不同處理組對鮮切蘋果失重率的影響如圖8所示。

圖8 涂膜處理對鮮切蘋果失重率的影響Fig.8 Effect of coating treatment on weight loss rate of fresh cut apple

由圖8可知，在整個儲藏期間，各試驗組的失重率均出現(xiàn)上升趨勢。W組和W+P組的失重率顯著低于CK組（P＜0.05），這可能是由于涂膜處理在鮮切蘋果表面形成了一層薄膜，這層乳清分離蛋白薄膜具有一定的阻水性能[32-33]，阻止由于蒸騰作用造成的水分散失。從W組和W+P組4 d～8 d的失重率結果可以看出，W+P組的失重率低于W組，且趨勢逐漸增大，且到第8天出現(xiàn)了顯著性差異（P＜0.05）。

2.3.3 鮮切蘋果的色澤變化

鮮切果蔬的色澤是影響消費者對其品質(zhì)感知的一個重要指標，也是影響其貨架壽命的主要因素。不同處理組對鮮切蘋果色澤的影響如圖9所示。

圖9 涂膜處理對鮮切蘋果L*值、C*值和外觀色澤變化的影響Fig.9 Effect of coating treatment on L*value，C*value and appearance color change of fresh cut apple

L*值是評價鮮切蘋果褐變程度的一個重要指標。L*值越低，表示儲藏期間由酶促褐變或色素聚集而引起的水果褐變越嚴重。由圖9可知，0～6 d，W組和W+P組的L*值均高于CK組，這是因為涂膜可以隔絕氧氣，阻止鮮切蘋果氧化褐變。另外，W+P組在整個儲藏期間L*值無明顯變化，說明TEO對鮮切蘋果起到了良好的抗氧化作用。C*值表示樣品的顏色飽和度，在整個儲藏期間，CK組的C*值呈現(xiàn)明顯上升趨勢，且均高于W組和W+P組。

鮮切蘋果的外觀色澤變化可從圖9比較直觀地看出，W+P組的外觀顏色優(yōu)于其他組別。隨著儲藏時間的延長，CK組的鮮切蘋果褐變程度逐漸加深；W組的蘋果在前6 d內(nèi)沒有出現(xiàn)很明顯的褐變現(xiàn)象，而在8 d時褐變現(xiàn)象明顯。這些現(xiàn)象都與前面所測鮮切蘋果L*值以及C*值數(shù)據(jù)保持一致。

3 結論

本文以包埋率和體系穩(wěn)定性為評價指標，通過單因素試驗得到負載TEO Pickering乳液最佳制備條件為WPI與AP質(zhì)量比1∶2、顆粒質(zhì)量濃度2.7%、熱改性溫度80℃、超聲強度4.35 W/cm2。另外，抑菌試驗結果表明，負載TEO Pickering乳液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌均具有顯著的抑菌活性。在對鮮切蘋果的涂膜保鮮研究中，負載TEO Pickering乳液涂膜處理大大降低了鮮切蘋果的腐爛率，并基本維持了其原有色澤。本研究對WPI-AP協(xié)同穩(wěn)定TEO Pickering乳液在鮮切果蔬保鮮方面的應用提供了重要的參考價值。