miR-124-3p靶向Axin1 調(diào)控糖尿病骨質(zhì)疏松成骨的研究

王斌 麥彩園 汪志中 李新旭 董俊球*

1.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣東 佛山528100 2.廣東省婦幼保健院產(chǎn)科，廣東 廣州510010

2型糖尿病患者在中國(guó)的發(fā)病年齡逐漸變小[1]。糖尿病患者常見的一種并發(fā)癥為骨質(zhì)疏松。在骨質(zhì)疏松的糖尿病患者中，骨微結(jié)構(gòu)受損，骨量減少和脆性骨折增加[2]。越來越多的證據(jù)表明，糖尿病會(huì)增加患骨質(zhì)疏松癥骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，必須開發(fā)有效的防治骨質(zhì)疏松癥的措施來預(yù)防和干預(yù)[4]。

近年來，miRNA對(duì)BMSCs及成骨細(xì)胞分化的影響已成為熱點(diǎn)問題, 史宏利等[5]研究人BMSCs中miRNA的表達(dá)差異，體外研究證實(shí)miR-124-3p對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化起調(diào)控作用，在老年小鼠骨組織中也發(fā)現(xiàn)miR-124-3p表達(dá)上調(diào)，該miRNA在骨組織的退化及骨質(zhì)疏松形成和發(fā)展過程中發(fā)揮較大作用。研究[6]表明，Wnt通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞作用于成骨細(xì)胞分化，在糖尿病骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。BMSCs可激活骨誘導(dǎo)基因然后經(jīng)過Wnt通路調(diào)控誘導(dǎo)骨分化[7]。Wnt的激活可以促進(jìn)成骨，增加骨量，并促進(jìn)骨的愈合，Axin1(axis inhibitor factor 1，軸抑制蛋白1)是Wnt/β-catenin通路里Wnt下游一個(gè)抑制骨形成的因子，它是一種多功能的構(gòu)架蛋白，在許多重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路中扮演著重要的角色。它參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、干細(xì)胞再生、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、代謝、分化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[8]。

本研究中建立糖尿病誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型，分析miR-124-3p通過Wnt通路的因子Axin1 對(duì)成骨分化產(chǎn)生的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

PCR檢測(cè)系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀：Bio-Rad公司，美國(guó)。熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)、骨密度儀：Progmega公司，美國(guó)。Trizol、RT-PCR試劑盒(M-MLV)：碧云天公司，中國(guó)。ALP試劑盒、茜素紅染色試劑盒、載體：Bio-Rad公司，美國(guó)。檸檬酸鹽緩沖液、鏈脲霉素(STZ)：研謹(jǐn)生物科技有限公司，中國(guó)。ELISA試劑盒：Takara公司，中國(guó)。培養(yǎng)液、Percoll液、胰酶、抗體、成骨誘導(dǎo)液、LipofectamineTM2000：無錫百邁格生物科技有限公司，中國(guó)。堿性磷酸酶染色試劑盒、茜素紅染色溶液、miR-124-3p模擬物：Bio-Rad公司，美國(guó)。胎牛血清、p-MiR report質(zhì)粒、293 T細(xì)胞：Invitrogen公司，美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本研究方案經(jīng)由佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院的倫理委員會(huì)審查通過。從中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買糖尿病大鼠模型-SPF級(jí)SD雌性大鼠20只，年齡7～10周，體重130～200 g，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。對(duì)照組腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液，實(shí)驗(yàn)組注射新鮮制備的2 %鏈脲霉素(STZ)(60 mg/kg)持續(xù)1周?？崭?2 h后測(cè)量血糖，濃度為16.67 mmol/L，表明該模型的成功建立。所有大鼠于8周后被處死，擺鋸于股骨近端1/3處截?cái)?，采集大鼠的骨髓組織及外周靜脈血清，并儲(chǔ)存在-80 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

20只大鼠分組為對(duì)照組10例、實(shí)驗(yàn)組10例，經(jīng)過藥物注射，ELISA檢測(cè)血生化指標(biāo)，骨密度儀測(cè)骨密度。BMSCs培養(yǎng)，流式細(xì)胞學(xué)鑒定。檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組miR-124-3p mRNA的表達(dá)。過表達(dá)miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d，檢測(cè)ALP、茜素紅染色成骨能力。第7天檢測(cè)miR-124-3p mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用miR-124-3p模擬物轉(zhuǎn)染，分為高糖組和低糖組，檢測(cè)中Axin1 mRNA水平。構(gòu)建載體，與模擬物共轉(zhuǎn)染，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-124-3p和Axin1靶向結(jié)合。將實(shí)驗(yàn)組BMSCs分為高糖組和低糖組，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組BMSCs高糖組及低糖組miR-124-3p、Runx2 mRNA的表達(dá)及茜素紅染色和ALP染色結(jié)果。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組模擬物在高糖組及低糖組miR-124-3p、Runx2 mRNA的表達(dá)及茜素紅染色和ALP染色結(jié)果。

1.4 ELISA檢測(cè)生化指標(biāo)

ELISA檢測(cè)糖尿病模型大鼠的血清生化指標(biāo)，β 膠原降解產(chǎn)物(β-CTX)、骨鈣素(OC)、硬化素(SOST)評(píng)估骨的吸收和形成；總?cè)８视?TG)、總膽固醇(TC)評(píng)估脂質(zhì)代謝；空腹血糖FPG和血紅蛋白A1C-HBA1C評(píng)估葡萄糖代謝；骨密度儀檢測(cè)大鼠腰椎骨密度(g/cm2)。驗(yàn)證糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型的有效性。

1.5 BMSCs培養(yǎng)

取骨髓2.5 mL，置于抗凝管中。將骨髓與等體積的含1 %雙抗的培養(yǎng)液混合。離心，去除上清。重懸細(xì)胞，緩慢注入Percoll液，離心，吸取中間細(xì)胞層，加培養(yǎng)基，吹打混勻于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每24 h換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞。胰酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL，培養(yǎng)。融合度達(dá)到70 %以上，傳至3代。

1.6 BMSCs鑒定

細(xì)胞離心，分裝于管中，離心后棄PBS液，保留50 μL，于每管細(xì)胞樣品中加的CD34、CD45、CD73、CD105以及單克隆抗體各10 μL，孵育，清洗，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 轉(zhuǎn)染

將轉(zhuǎn)染模擬物(10 μL)和對(duì)照片段(200 nmol)溶解于150 μL光學(xué)MEM-細(xì)胞培養(yǎng)基中制備模擬混合物。LipofectamineTM2000 (5 μL) 溶解于150 μL的Opti-MEM I(1X)還原血清培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)染溶液。細(xì)胞播種在6孔板，在堿性α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將轉(zhuǎn)染溶液和模擬混合物混合，在細(xì)胞密度達(dá)到80 %混雜度時(shí)加入細(xì)胞，并孵育20 min。然后將混合物加入細(xì)胞中，在37 ℃的5 % CO2環(huán)境中孵化，加入無青霉素/鏈霉素的完整培養(yǎng)基2 mL。將實(shí)驗(yàn)組BMSCs分為用30 mmol/L葡萄糖處理的高糖組和用5.6 mmol/L葡萄糖處理的低糖組。將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物(過表達(dá))，同法分高糖組和低糖組。

1.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

從BMSCs中用Trizol提取RNA。用Nano-100微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量。使用通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。GoTaq? qPCR Master Mix(A6002)用于檢測(cè)Axin1、Runx2、miR-124-3p的水平。使用Primerpremier5設(shè)計(jì)引物(表1)。miRNA的相對(duì)表達(dá)內(nèi)參為U6，其他的相對(duì)表達(dá)內(nèi)參為β-action。

1.9 雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)

利用http://www.targetscan.org/vert_71/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-124-3p可能結(jié)合的Wnt通路靶位點(diǎn)Axin1。構(gòu)建野生型靶基因3’端非翻譯區(qū)熒光素酶報(bào)告基因載體pMIR-Axin1-WT及 miR-124-3p 靶序列突變型載體pMIR-Axin1-MT。將實(shí)驗(yàn)組BMSCs細(xì)胞接種于24孔板，用Lipofectamine 2000將pMIR-Axin1-WT、pMIR-Axin1-MT熒光報(bào)告載體與miR-124-3p 模擬物共轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。確定 miR-124-3p 靶向結(jié)合基因Axin1。

1.10 堿性磷酸酶(ALP)染色

用堿性磷酸酶染色試劑盒(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行ALP染色。將細(xì)胞植入6孔板，用4 %對(duì)甲醛(pH 7.4)固定1～2 min，用磷酸鹽緩沖鹽(PBS)和三緩沖鹽水(TBST)洗滌兩次。加入ALP染色溶液覆蓋細(xì)胞，在室溫下陰涼處孵育15～20 min。丟棄ALP染料后，用PBS清洗細(xì)胞。然后在孔中添加適當(dāng)量的PBS，顯微鏡下觀察。在定量分析中，用10 %十二酰氯化吡啶去除ALP染料15 min，并測(cè)量在540 nm處的吸光度，然后計(jì)算出相對(duì)的ALP活性。

1.11 茜素紅染色

將細(xì)胞種到6孔板中，4 %的多聚甲醛固定15～30 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入0.2 %茜素紅染色溶液(pH 8.3)1～5 min。高葡萄糖條件轉(zhuǎn)染miR-124-3p 模擬物，孵育，在顯微鏡下觀察。然后用20 %甲醇和10 %醋酸的溶液溶解茜素紅染料，并通過測(cè)量其在570 nm處的吸光度進(jìn)行量化。然后計(jì)算相對(duì)茜素紅染色。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂質(zhì)代謝

實(shí)驗(yàn)組TG、TC、FPG、HbA1C值上調(diào)(圖1 a、b、c、d)，β-CTX和SOST上調(diào)，OC和骨密度下調(diào)(圖1 e、f、g、h)。

圖1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂質(zhì)代謝、骨密度(*P<0.05)Fig.1 Glucose and lipid metabolism and bone mineral density in diabetic model rats (* P <0.05)

2.2 BMSCs鑒定

流式細(xì)胞術(shù)分析BMSCs(圖2)：CD73和CD105的表達(dá)為陽性，CD34 和 CD45 的表達(dá)呈陰性。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原特點(diǎn)，證實(shí)為BMSCs。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記分子Fig.2 Flow cytometry analysis of BMSCs cell surface marker molecules

2.3 miR-124-3p調(diào)控BMSC成骨分化及高糖組中Axin1 RNA表達(dá)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)miR-124-3p表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組(圖 3a)。過表達(dá)miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d，ALP、茜素紅染色隨時(shí)間逐漸升高(圖3b、c)。模擬物轉(zhuǎn)染后7 d miR-124-3p表達(dá)水平顯著升高(圖3 d)。高糖組中Axin1 RNA表達(dá)水平上調(diào)，但用miR-124-3p模擬物轉(zhuǎn)染時(shí)水平下降(圖 3e)。

注：a：miR-124-3p在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組表達(dá)；b、c ：ALP、茜素紅染色；d：模擬物轉(zhuǎn)染miR-124-3p水平；e：高糖組中Axin1 表達(dá)及模擬物轉(zhuǎn)染時(shí)水平；*P<0.05。圖3 miR-124-3p調(diào)控BMSCFig.3 MiR-124-3 p regulation of BMSC

2.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-124-3p和Axin1靶向結(jié)合

用數(shù)據(jù)庫(www.targetscan.org)分析miR-124-3p和Axin1之間的關(guān)系，結(jié)果表明，miR-124-3p和Axin1具有靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。

熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-124-3p可抑制野生型野生型(pMIR-Axin1-WT)的螢光素酶活性，而不影響突變型(pMIR-Axin1-MT)活性(圖4)。

圖4 Targetscan網(wǎng)站證明靶向結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果(*P<0.05)Fig.4 Targetscan site proof of targeted binding site, luciferase reporter gene results (*P<0.05)

2.5 高葡萄糖誘導(dǎo)對(duì)miR-124-3p表達(dá)的影響和成骨性分化

高葡萄糖攝入顯著降低了miR-124-3p、Runx2表達(dá)(圖5 a、b)。通過茜素紅染色和ALP染色進(jìn)行病理分析，發(fā)現(xiàn)高糖可抑制成骨分化，減少鈣沉積，減少ALP表達(dá)(圖5 c、d)。

圖5 高葡萄糖和低葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中的miR-124-3p、 Runx2及成骨的表達(dá)水平(*P<0.05)Fig.5 Expression levels of miR-124-3p, Runx2, and osteogenesis in high and low glucose induced cells (*P<0.05)

2.6 高血糖條件下miR-124-3p過表達(dá)(模擬物)對(duì)成骨分化的影響

Runx2的表達(dá)顯示，高糖+對(duì)照明顯低于低糖+對(duì)照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對(duì)照組。茜素紅染色和ALP染色顯示，高糖+對(duì)照明顯低于低糖+對(duì)照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對(duì)照組。

圖6 高血糖條件下miR-124-3p過表達(dá)對(duì)成骨分化的影響(*P<0.05)Fig.6 Effect of miR-124-3p over-expression on osteogenic differentiation under hyperglycemia (*P<0.05)

3 討論

研究表明miRNA可以調(diào)節(jié)Wnt通路并參與成骨分化。miR-124-3p可通過調(diào)控Wnt通路促進(jìn)成骨分化[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，糖尿病性骨質(zhì)疏松癥患者中miRNA的差異會(huì)增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，miR-382-3p可以促進(jìn)骨的形成。有證據(jù)[8]表明，Wnt通路及Axin1參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、干細(xì)胞再生、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、代謝、分化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Wnt通路參與了糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的骨骼形成[11]。miR-124-3p參與Wnt通路的調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)成骨干細(xì)胞形態(tài)、成骨細(xì)胞粘附和成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄來參與成骨分化過程[12]。在Wnt信號(hào)未被激活時(shí)，Axin1作為一個(gè)支架蛋白與Gsk-3β和 APC形成降解復(fù)合物，降解胞質(zhì)中的 β-catenin，使其濃度較低。當(dāng)Wnt被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)DVL募集，DVL拮抗降解復(fù)合物的活性可以使β-catenin質(zhì)內(nèi)聚積，繼而發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在TCF/LEF的作用下，β-catenin引起下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13]。

本研究ELISA檢測(cè)血生化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組TG、TC、FPG、HbA1C值上調(diào)，β-CTX和SOST上調(diào)，OC和骨密度明顯下調(diào)，驗(yàn)證了糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型建立的有效性。大鼠BMSCs培養(yǎng)后，流式細(xì)胞學(xué)鑒定，CD73和CD105的表達(dá)呈陽性，CD34 和 CD45 的表達(dá)呈陰性。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原特點(diǎn)，證實(shí)為BMSCs。

實(shí)驗(yàn)組miR-124-3p表達(dá)明顯低于對(duì)照組。過表達(dá)miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d后，ALP、茜素紅染色隨時(shí)間逐漸升高。模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-124-3p表達(dá)水平顯著升高。證明了糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠股骨miR-124-3p下調(diào)，miR-124-3p是一個(gè)成骨因子。

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用miR-124-3p模擬物轉(zhuǎn)染，結(jié)果高糖組Axin1 RNA表達(dá)水平上調(diào)，但用miR-124-3p模擬物轉(zhuǎn)染時(shí)水平下降。用數(shù)據(jù)庫研究miR-124-3p和Axin1具有靶向結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示miR-124-3p可顯著抑制野生型pMIR-Axin1-WT的螢光素酶活性，而不影響突變型pMIR-Axin1-MT熒光報(bào)告基因活性。證實(shí)了miR-124-3p可靶向調(diào)節(jié)Axin1，兩者為相反的關(guān)系。

RT-qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組BMSCs高糖攝入顯著降低了miR-124-3p、Runx2表達(dá)；高糖可抑制成骨分化，減少鈣沉積，減少ALP表達(dá)。這說明了高糖的成骨抑制性，高糖抑制miR-124-3p及成骨因子。高血糖條件下miR-124-3p過表達(dá)(模擬物)中Runx2的表達(dá)顯示，高糖+對(duì)照明顯低于低糖+對(duì)照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對(duì)照組。茜素紅染色和ALP染色顯示，高糖+對(duì)照明顯低于低糖+對(duì)照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對(duì)照組。這說明高葡萄糖的情況下，miR-124-3p過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)BMSC成骨標(biāo)志物Runx2。茜素紅染色和ALP染色證明，miR-124-3p過表達(dá)能恢復(fù)高糖對(duì)骨發(fā)生的抑制作用，同時(shí)升高高葡萄糖誘導(dǎo)的鈣沉積和ALP的表達(dá)。

總之，本研究證明了 miR-124-3p能通過靶向抑制Axin1促進(jìn)糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠BMSC的成骨發(fā)生。本文為臨床治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥提供了新的理論，我們可以通過調(diào)控miR-124-3p及其靶因子Axin1的水平治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥。