肌少癥造模方法的研究進(jìn)展

周曉寧 袁帥趙啟葉潔 莫文 許金海*

1. 河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院) ，河南 鄭州 450000 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032

肌少癥是指由于肌纖維萎縮和喪失導(dǎo)致的肌肉功能和質(zhì)量下降的老年綜合征，可增加老年人跌倒和骨折的風(fēng)險。據(jù)統(tǒng)計，至2018年我國60歲以上人口高達(dá)25%，預(yù)計2050年65歲以上人口將超過4億[1]。60～70歲人群肌少癥發(fā)病率為5%～13%，80歲以上將高達(dá)11%～50%[2]。目前肌少癥的治療主要為抗阻訓(xùn)練及營養(yǎng)補(bǔ)充[3]，安全性與療效性高的治療方案仍然是醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)需繼續(xù)探索的領(lǐng)域。在對其進(jìn)行診療研究的過程中，選擇適宜的動物模型至關(guān)重要。隨著對肌少癥研究的深入，造模方法逐漸多樣化，文獻(xiàn)報道有懸吊法、藥物注射法、手術(shù)法、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。探索出更接近人類肌少癥發(fā)病機(jī)制與表現(xiàn)的動物模型是研究的關(guān)鍵步驟，故擬通過查閱文獻(xiàn)，總結(jié)并探討各造模方法的利弊，以期為肌少癥的診斷、治療奠定實驗學(xué)基礎(chǔ)。

1 肌少癥模型的評定標(biāo)準(zhǔn)

研究表明肌少癥與肌纖維數(shù)量和橫截面積下降及蛋白質(zhì)凈降解、炎癥反應(yīng)加劇、肌肉調(diào)控因子失調(diào)等因素密切相關(guān)，表現(xiàn)為肌量減少、肌力下降和肌肉功能減退。以骨骼肌質(zhì)量下降、肌力減弱為評判指標(biāo)。動物模型肌肉質(zhì)量的檢測與人類相仿，可通過生物電阻抗(BIA)、磁共振(MRI)、雙能X線(DXA)等儀器檢測；肌肉的力量和功能可通過測量前肢抓力和轉(zhuǎn)棒式疲勞儀評估[4]。

2 肌少癥造模方法

2.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)造模法

2.1.1轉(zhuǎn)基因過表達(dá)人源腫瘤壞死因子基因小鼠：隨著基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在造模方面有較多應(yīng)用。小鼠的基因可控性為基因敲除和轉(zhuǎn)基因的實驗方法提供便利。研究[2]表明炎癥因子如TNF-α、IL-1β 、IL-6 、TGF-β等在骨骼肌過多積累可導(dǎo)致肌肉萎縮，從而導(dǎo)致肌少癥的發(fā)生。依香叫等[5]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用人類血紅蛋白P基因序列(human hemoglobinbeta,HBB)取代修飾小鼠聚腺苷酸化信號和側(cè)翼序列，最終形成轉(zhuǎn)基因過表達(dá)人源腫瘤壞死因子基因(human tumour necrosis factor,hTNF)的小鼠，此種修飾確保了TNF-α的轉(zhuǎn)錄效率，導(dǎo)致肌肉萎縮，最終發(fā)展為肌少癥。

2.1.2(Pro)腎素受體轉(zhuǎn)基因小鼠：Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)生、癌變和干細(xì)胞自我更新、分化中發(fā)揮重要作用。該通路可促進(jìn)衰老，并與肌肉細(xì)胞再生能力下降有關(guān)。(Pro)腎素受體[(P) RR]是Wnt/β-catenin信號通路的激活物。(P)RR通過增加腎素的催化活性來提高血管緊張素I的生成。骨骼肌中(P)RR過表達(dá)可激活Wnt/β-catenin和YAP信號通路，從而損傷肌肉修復(fù)過程中成肌細(xì)胞融合，導(dǎo)致骨骼肌生長紊亂。研究[6]發(fā)現(xiàn)(P)RR轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠可表現(xiàn)出獨(dú)特的骨骼肌萎縮，并伴有肌少癥特征，可作為肌少癥的造模方法。

2.1.3MKR小鼠與Akt1 /Akt2 雙敲除小鼠：MKR小鼠是轉(zhuǎn)基因2型糖尿病小鼠，其抗疲勞、耐缺氧、麻醉耐受能力均較差，目前較多用于糖尿病的研究。MKR小鼠骨骼肌中由于IGF-1受體缺失，影響小鼠的肌肉發(fā)育生長。Mavalli等[7]發(fā)現(xiàn)，MKR小鼠在 6 周齡和16 周齡肌纖維橫截面積均明顯低于野生型小鼠。此外，Akt1 /Akt2 雙敲除的小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長缺陷及骨骼肌萎縮，與 IGF-1 受體缺失小鼠類似[8]。盡管這兩種類型的小鼠都表現(xiàn)出肌肉萎縮，但 Akt 雙敲除的小鼠主要表現(xiàn)為肌細(xì)胞尺寸減少，而 IGF-1 缺失的小鼠則表現(xiàn)為肌細(xì)胞數(shù)量的減少[9]。

2.2 試劑注射法

2.2.1地塞米松注射法：地塞米松(dexamethasone，DXM) 屬于糖皮質(zhì)激素，一定劑量的DXM具有抗炎、抗過敏的功效，持續(xù)大劑量的DXM則會造成肌肉萎縮。已有研究[9-11]發(fā)現(xiàn)對小鼠皮下注射DXM，維持10～19 d，小鼠的肌肉質(zhì)量和功能明顯下降，可作為肌少癥造模的方案。

2.2.2肉毒毒素A注射法：肉毒毒素A(botulinum toxin，BTX) 是一種高分子蛋白毒素，運(yùn)動神經(jīng)元傳導(dǎo)神經(jīng)沖動后，釋放乙酰膽堿，經(jīng)終板電位改變后出現(xiàn)肌肉動作電位，產(chǎn)生肌肉收縮。BTX通過作用于神經(jīng)肌肉接頭突觸前，阻斷神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿的運(yùn)轉(zhuǎn)、融合和釋放，使肌肉麻痹，從而導(dǎo)致肌肉的快速丟失[12]，也被應(yīng)用于建立肌少癥模型。此外，通過高脂飲食配合藥物注射造?？纱龠M(jìn)小鼠肌肉萎縮，朱國濤等[13]的研究便是給予小鼠高脂高糖飲食并注射鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病肌少癥小鼠模型。

2.2.3手術(shù)法：手術(shù)法主要包括全胃切除術(shù)、坐骨神經(jīng)切除術(shù)及卵巢切除術(shù)。Haba Y等[14]通過全胃切除構(gòu)建大鼠肌少癥模型，全胃切除大鼠可出現(xiàn)體重減輕、肌肉質(zhì)量減少和肌肉萎縮。根據(jù)實驗動物的肌肉重量、肌肉萎縮標(biāo)志物表達(dá)、蛋白質(zhì)合成標(biāo)志物表達(dá)和血液參數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)和谷氨酰胺(glutamine，Glu)可抑制atrogen -1或MuRF1，并具有協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)而可抑制小鼠體重下降和肌肉萎縮。Kinoshita H等[15]通過切除坐骨神經(jīng)誘發(fā)肌肉萎縮，建立肌肉減少癥動物模型。但肌纖維去神經(jīng)支配是否與肌肉細(xì)胞或神經(jīng)元的有害變化有關(guān)，或與兩者都有關(guān)系，目前尚不清楚。部分學(xué)者[16]認(rèn)為雌性大鼠卵巢切除術(shù)可作為肌少癥建模法，但是隨著雌激素水平的下降，實驗動物的肌肉質(zhì)量及骨量均受影響，該法更適用于活動障礙綜合癥的造模。

2.3 物理造模法

2.3.1后肢懸吊法：后肢懸吊法(hind limb suspension，HLS)通過后肢懸吊模擬微重力條件造成肌肉質(zhì)量和力量均降低，成為廢用性肌肉萎縮模型[17-18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)大鼠后肢懸吊4周后，比目魚肌和跖肌的收縮張力和質(zhì)量下降約50%。該法的優(yōu)點是無需藥物干預(yù)，對實驗動物整體影響較小。但是HLS造模的小鼠，I型慢速肌纖維的減少比II型快速肌纖維的減少更明顯，這種微重力狀況下的肌肉萎縮與老年人肌少癥病理機(jī)制并不相符[20]。

2.3.2關(guān)節(jié)位置固定法：關(guān)節(jié)位置固定部位的肌肉失去收縮舒張等活動，從而引起肌肉萎縮 ，此方法常被用作模擬骨折后的石膏、繃帶固定。大鼠被固定關(guān)節(jié)限制活動一段時間后，會造成大鼠肌肉的廢用性萎縮，從而建立大鼠肌少癥模型。Ohira等[21]的研究對成年Wistar大鼠進(jìn)行后肢固定，經(jīng)過10 d的固定就成功造成了比目魚肌出現(xiàn)廢用性萎縮。

2.3.3直接選材法：雖然較多造模方法可以使實驗動物肌肉萎縮和功能下降，但是與實際肌少癥的病理機(jī)制仍存在一定的差異。研究[25]發(fā)現(xiàn)18月齡小鼠可成功建立自然衰老小鼠模型，其運(yùn)動能力明顯下降，且骨骼肌萎縮以II型肌細(xì)胞為主，與肌少癥病理變化更相符。單純自然衰老模型造模時間較長，越來越多的研究[22]通過衰老+高脂飲食以縮短造模時間，高脂飲食使身體脂肪組織明顯增加，增強(qiáng)肌肉組織內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重骨骼肌的萎縮、老化，使骨骼肌纖維變細(xì)，肌肉力量減退。有學(xué)者[23]予小鼠高脂飲食 (high-fat diet，HFD)后發(fā)現(xiàn)小鼠的脂肪組織明顯增加而肌肉組織減少、肌力明顯下降，并且以IL-6、TNF-α為代表的炎癥指標(biāo)增加。

2.3.4加速衰老模型：研究骨骼肌衰老最常用的動物模型是大鼠和小鼠。然而，即使在嚙齒動物中，進(jìn)行終生干預(yù)仍需要18～26個月的隨訪，成本高且耗時長，而加速衰老模型在一定程度上可節(jié)約時間和成本。加速衰老小鼠(senaging - accelerated Mouse, SAM)由18個品系組成，根據(jù)壽命、衰老評分和病理表型數(shù)據(jù)，通過親本AKR/J小鼠重復(fù)選擇性近交，建立具有加速衰老和衰老相關(guān)病理的衰老傾向自交系(SAMP)及由具有正常衰老的抗衰老自交系(SAMR)組成的SAM模型[24]。其中11個衰老易感自交系(senaging -prone inbred strain, SAMP)和7個抗衰老自交系(senaging -resistant inbred strain, SAMR)被認(rèn)為是肌少癥研究的良好選擇[25]。其中SAMP8由于其高氧化應(yīng)激狀態(tài)，表現(xiàn)出加速肌肉老化、肌肉質(zhì)量下降、壽命短的典型特征，相較于SAMP6能夠更早、更快的出現(xiàn)肌肉質(zhì)量和力量的下降，且肌肉萎縮以II型肌纖維為主[16]，與人類肌少癥病理變化相一致，因此SAMP8小鼠是研究肌少癥較理想的動物模型[26-27]。

3 討論

綜上所述，隨著對肌少癥研究的深入，造模時間短、存活率高、方便干預(yù)且病理機(jī)制與人類相符的造模方法逐漸成為研究熱點。轉(zhuǎn)基因技術(shù)造模法的指向性更明確，但對實驗研究者的技術(shù)要求高，轉(zhuǎn)基因小鼠存活率也是需納入考慮的因素之一；試劑注射造模方法簡單，注射劑量及藥物便于控制，可重復(fù)性高。然而單純注射造?？赡軐Χ嘞到y(tǒng)產(chǎn)生作用，尤其部分藥物在對肌肉產(chǎn)生作用的同時，往往伴有骨質(zhì)丟失，該法與手術(shù)法均能對肌肉和骨骼產(chǎn)生作用，此類造模方式更貼近活動障礙綜合征。且目前對試劑選用、藥物劑量和注射周期缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，副作用尚不明確；物理造模法無需藥物干預(yù)，造模簡便且易于操作，與廢用性肌肉萎縮存在一定程度相似性。但是此類方法在肌肉萎縮過程中，I型慢速肌纖維的減少量大于II型快速肌纖維，其肌肉衰減所表現(xiàn)出的癥狀與老年人不相符。不僅如此，目前關(guān)于使用關(guān)節(jié)位置固定法進(jìn)行大鼠肌少癥建模的研究仍較少，其固定方式和固定干預(yù)時間仍需進(jìn)一步的研究探討；直接選材法與肌少癥發(fā)病機(jī)制的一致性較好，且病變以炎性反應(yīng)增加、II型肌細(xì)胞萎縮為主，有著自身的優(yōu)勢。但成本高、造模時間長也限制了其推廣應(yīng)用；加速衰老模型彌補(bǔ)了直接選材法的不足，SAMP8小鼠是研究肌少癥較理想的動物模型。

4 小結(jié)

骨骼肌具有調(diào)節(jié)能量代謝、維持溫度、支配活動、保護(hù)器官等重要生物學(xué)功能，在人類中，骨骼肌約占體重的40 %，年齡和慢性病中的肌纖維萎縮與喪失是導(dǎo)致喪失獨(dú)立能力、殘疾、需要長期護(hù)理以及總體死亡率升高的主要因素[1,28-29]。研究表明轉(zhuǎn)基因技術(shù)、炎癥反應(yīng)失調(diào)、高脂飲食、廢用性萎縮、手術(shù)干預(yù)、藥物注射均可誘發(fā)肌少癥，然而各造模方法均有優(yōu)缺點，需要視情況選擇。筆者認(rèn)為在具有技術(shù)支持及可實施的基礎(chǔ)上，SAMP8小鼠是研究肌少癥的較好模型。自然衰老造模法次之，該法的病理改變、癥狀與肌少癥的一致性良好，然而存在時間久、成本高的缺點。探索出一種時間短、成本低并且能夠高度模擬人體肌少癥的模型仍是未來需要研究的方向。