馬名嘉 石娟 劉立剛 魏翔 青瑩
主動脈瓣膜鈣化隨著年齡增長而逐漸加重,最終會引發(fā)瓣膜關(guān)閉不全和(或)狹窄,導(dǎo)致心力衰竭、心肌梗塞。瓣膜長期受血流沖擊以及細(xì)胞老化凋亡影響,瓣膜內(nèi)大量分布的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(valvular intestinal cells,VICs)發(fā)生促纖維化和促成骨過程,在病理條件下,引起瓣膜鈣化[1],其發(fā)生發(fā)展受到物理因素和代謝分子調(diào)控影響,目前仍無有效預(yù)防方法,終末期治療手段是人工瓣膜置換[2]。細(xì)絲蛋白B(filamin B,FLNB)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白,作為細(xì)胞骨架和多功能信號支架,參與細(xì)胞凋亡等病理進(jìn)程。FLNB在各組織中廣泛表達(dá),既往研究聚焦于FLNB突變對骨骼系統(tǒng)發(fā)病的影響,它也有可能參與主動脈瓣鈣化進(jìn)程。我們對人鈣化心臟瓣膜中FLNB的表達(dá)進(jìn)行分析。
2021年8月~2022年1月我院手術(shù)中切除的鈣化主動脈瓣9例(鈣化組),女性4例,男性5例。同期因主動脈夾層手術(shù)切除的外觀正常的主動脈瓣8例作為對照組,鈣化組病人年齡偏大(見表1)。鈣化性主動脈瓣疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn):心臟彩超檢查提示瓣膜鈣化,術(shù)中探查發(fā)現(xiàn)主動脈瓣有明顯鈣化結(jié)節(jié),直徑超過1 mm。排除感染性心內(nèi)膜炎、風(fēng)濕性心臟病以及結(jié)締組織病等疾病。所有病人均簽署知情同意書。
表1 兩組病人一般資料比較
1.組織樣本處理:將主動脈瓣組織經(jīng)福爾馬林溶液充分固定后脫水、包埋并切片。另一部分剪碎為米粒大小在液氮中處理后保存于-80 ℃。
2.茜素紅染色:組織切片用2%茜素紅S染色液按標(biāo)準(zhǔn)染色流程染色封片,后于正置顯微鏡下觀察并拍照。
3.免疫組織化學(xué)(IHC)SP法染色:采用IHC檢測主動脈瓣中FLNB的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位。按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行免疫組化染色,即利用檸檬酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù),并經(jīng)3%的過氧化氫和8%羊血清室溫封閉非特異性抗原,隨后加入FLNB特異性一抗(1∶100稀釋)4 ℃下孵育過夜,次日用PBS洗滌3次,用二抗孵育60 分鐘,滴加顯色液,顯微鏡下觀察控制顯色時間,蘇木素復(fù)染,二甲苯透明后封片。對每張切片在高倍鏡下任取5個區(qū)域采集圖像,染色區(qū)域取平均光密度值進(jìn)行比較。
4.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot):進(jìn)一步應(yīng)用Western Blot檢測FLNB蛋白表達(dá)水平。按文獻(xiàn)[3],將主動脈瓣組織在液氮中研磨碎,加入裂解液,于冰浴中靜置裂解,用超聲破碎儀進(jìn)一步破碎,取上清。使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后抗體封閉,F(xiàn)LNB一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜,孵育二抗,室溫反應(yīng)30分鐘,洗膜。用ECL顯色,在凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白信號。
1.茜素紅染色結(jié)果見圖1A、B。主動脈鈣化組切片可見瓣膜組織層次不清,明顯增生融合,淺紅色組織紋理間有散在深紅色鈣化結(jié)節(jié),對照組病人瓣膜切片經(jīng)染色后為均勻淺紅色質(zhì)地,未見鈣化結(jié)節(jié)。
2.瓣膜IHC結(jié)果見圖1C、D。IHC染色可以看見,F(xiàn)LNB在鈣化組及對照組切片中均有表達(dá),大部分位于瓣膜組織VICs細(xì)胞質(zhì)中。鈣化組平均光密度定量為(6.57±1.65)%,對照組為(0.91±0.52)%。鈣化組主動脈瓣組織中FLNB蛋白表達(dá)量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
A 正常瓣膜未見鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅染色×400);B 鈣化瓣膜有散在暗紅色鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅染色×400);C正常瓣膜少量細(xì)絲蛋白B顯色(SP×400);D鈣化瓣膜細(xì)絲蛋白B表達(dá)明顯,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),藍(lán)染為細(xì)胞核(免疫組化染色×400)
3.Western Blot結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,對照組可見FLNB蛋白表達(dá),在鈣化組病人主動脈瓣中,F(xiàn)LNB蛋白表達(dá)水平顯著升高,趨勢與免疫組化一致,檢測蛋白條帶灰度值并計算FLNB蛋白/actin蛋白比值,得出相對定量。對照組為(0.352±0.079),鈣化組為(0.652±0.037), 兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
圖2 細(xì)絲蛋白B(FLNB)Western Blot結(jié)果
4.FLNB表達(dá)與瓣膜鈣化的關(guān)系見圖3。以主動脈瓣茜素紅染色后鈣化區(qū)域所占視野面積比例表示鈣化程度。瓣膜鈣化程度與FLNB的蛋白表達(dá)呈正相關(guān),鈣化程度越嚴(yán)重,F(xiàn)LNB表達(dá)水平越高,Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.47,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.07)。
圖3 鈣化程度與FLNB水平相關(guān)性分析
瓣膜鈣化是一種活躍的生物成骨過程,在鈣化的主動脈瓣中可觀察到約13%骨形成[4]。主動脈瓣膜分為纖維層、海綿層和心室面三層,三層內(nèi)均分布有大量VICs,整個瓣膜結(jié)構(gòu)由一層瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞所包裹。在適當(dāng)條件刺激下,VICs可以分化為成骨細(xì)胞,表現(xiàn)為堿性磷酸酶的表達(dá)增高。VICs向成纖維細(xì)胞分化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在其周圍形成富含膠原的鈣化結(jié)節(jié),導(dǎo)致瓣膜組織彌漫性鈣化[5]。
有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)LNB可能參與心臟瓣膜疾病的發(fā)生。Yang等[6]對一個嚴(yán)重骨骼畸形的家系進(jìn)行全外顯子測序,發(fā)現(xiàn)一個FLNB基因移碼突變影響了FLNB二聚體結(jié)構(gòu)的形成。值得注意的是,上述致病突變的攜帶者都同時出現(xiàn)心臟瓣膜病變。本研究從分子表達(dá)層面證明FLNB在心臟瓣膜組織中的表達(dá),且主要分布于VICs細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。FLNB屬于細(xì)絲蛋白家族成員之一,在細(xì)胞內(nèi)以二聚體形式存在。二聚體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性很有可能是導(dǎo)致心瓣膜疾病的原因之一。
本研究通過IHC和Western Blot發(fā)現(xiàn),鈣化主動脈瓣組織中FLNB表達(dá)增高。FLNB可能在諸多方面對于瓣膜鈣化起到促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn),VICs在模擬瓣膜硬化條件下培養(yǎng),與正常VICs對比,前者FLNB基因的表達(dá)量顯著增高[7]。本研究結(jié)果從蛋白表達(dá)水平證實在鈣化瓣膜VICs中的FLNB富集。該現(xiàn)象提示,作為成骨分化的重要分子,F(xiàn)LNB可能直接參與瓣膜鈣化的病理進(jìn)程。作為細(xì)胞骨架構(gòu)成成分,F(xiàn)LNB可以介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接,導(dǎo)致白細(xì)胞的穿內(nèi)皮遷移。白細(xì)胞在瓣膜內(nèi)皮下的聚集可繼發(fā)炎癥反應(yīng),促進(jìn)瓣膜鈣化[8]。
FLNB功能缺陷會導(dǎo)致一系列病理生理改變。與正常細(xì)胞比較,F(xiàn)LNB功能缺陷的成纖維細(xì)胞顯示出肌動蛋白微絲紊亂無序、遷移能力下降的現(xiàn)象[2]。若VICs遷移能力下降,將進(jìn)一步促進(jìn)瓣膜的融合、增厚。此外,功能缺陷的FLNB會影響其他信號分子。Bandaru等[9]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)LNB缺陷會增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性。MMP-9可能參與細(xì)胞外基質(zhì)的纖維增生和鈣化。人體內(nèi)FLNB突變還會促進(jìn)β-連環(huán)蛋白表達(dá),后者在瓣膜組織中參與調(diào)控VIC成骨分化,導(dǎo)致瓣膜鈣化[10]。
本研究樣本為終末期鈣化瓣膜樣本,未能在主動脈瓣鈣化發(fā)病早期探究FLNB的表達(dá)情況。