黃精山楂復(fù)合酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化及品質(zhì)變化

王印壯，費(fèi)鵬，馬艷莉，，牟建樓*，馬艷，范成偉，董格格

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 473004）

黃精（Polygonatum sibiricum）和山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）同屬我國重要的藥食兩用種質(zhì)資源。黃精為百合科黃精屬（Polygonatum Mill.）植物，富含多種生物活性成分，如黃精多糖、甾體皂苷、黃酮及氨基酸等，研究表明，黃精具有調(diào)節(jié)血糖、降低血脂、提高免疫力及抗病毒等功效；山楂為薔薇科山楂屬（Crataegus L.）植物，富含黃酮、三萜類、維生素以及有機(jī)酸等活性成分，具有改善脂代謝、調(diào)節(jié)胃腸功能以及預(yù)防心腦血管疾病等功效。隨著社會的發(fā)展和人們健康意識的提高，具有重要生理功能的黃精、山楂等藥食同源類資源在食品領(lǐng)域的發(fā)展逐漸受到重視。朱建平等以黃精、山楂及牛奶為原料開發(fā)出口感、色澤以及風(fēng)味俱佳的新型酸奶產(chǎn)品，并研究其對高脂大鼠模型的降脂作用，發(fā)現(xiàn)其具有良好的降脂功能。張建萍等采用單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃精、山楂為原料，研發(fā)出一種具有獨(dú)特口感、發(fā)酵醇酯香的黃精山楂功能保健酒。此外，研究還發(fā)現(xiàn)黃精和山楂配合使用，對于調(diào)節(jié)高脂血癥、改善胃腸功能以及亞健康等具有積極作用。因此，以黃精、山楂為主要原料，聯(lián)合開發(fā)具有功效作用的新型食品具有廣闊市場前景。

食用植物酵素是指以水果、蔬菜、藥食同源類植物等為原料，經(jīng)有益微生物發(fā)酵制得的含有酚類、多種功效酶以及氨基酸等生物活性成分的產(chǎn)品，具有抗氧化、解酒護(hù)肝以及潤腸通便等功效。酵素通過發(fā)酵劑的發(fā)酵作用將原料中的物質(zhì)進(jìn)行分解，形成各種生理活性產(chǎn)物釋放于基質(zhì)之中，同時(shí)還可保留發(fā)酵益生菌，使其既具有功能性又富含風(fēng)味成分。因此，可以考慮以黃精、山楂為原料，通過乳酸菌的發(fā)酵制備集聚風(fēng)味和功能性的新型復(fù)合酵素，從而拓展黃精與山楂在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

綜上，本研究通過考察不同乳酸菌的生長性能和耐酸特性，篩選出兩株具有良好發(fā)酵性能的乳酸菌用于制備酵素；以黃精、山楂為主要原料，采用單因素試驗(yàn)，分析菌種體積比、黃精與山楂質(zhì)量比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素總黃酮含量和感官評分的影響；利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，并對其發(fā)酵前后感官品質(zhì)、基本理化指標(biāo)及功能性成分的變化進(jìn)行分析，以反映其品質(zhì)變化，從而制備出一種具有良好風(fēng)味和營養(yǎng)保健功能的新型黃精山楂復(fù)合酵素產(chǎn)品，以期促進(jìn)黃精、山楂在食品領(lǐng)域的發(fā)展，為黃精山楂復(fù)合酵素的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精（一蒸一曬）：河南聯(lián)源生物科技股份有限公司，經(jīng)鑒定為百合科黃精屬植物黃精（Polygonatum sibiricum Red.）；山楂干、紅糖：市售。

植物乳桿菌ACCC 11095、植物乳桿菌AS 1.2437、類干酪乳桿菌CICC 21019、干酪乳桿菌ATCC 334、短乳桿菌GDMCC 1.288：北京生物保藏中心。

果膠酶（500 U/mg）、纖維素酶（50 U/mg）：諾維信有限公司；MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津登科化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚（均為分析純）：天津科密歐試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C022E榨汁攪拌機(jī)：九陽股份有限公司；UV-752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ME-204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；RHB數(shù)字折光儀：上海奮業(yè)光電儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵劑的篩選

1.3.1.1 生長曲線測定

采用比濁法，將5種乳酸菌活化液（菌液濃度>1.02×10CFU/mL），以3%接種量分別接種于MRS肉湯中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng) 24 h，于 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 取樣，測定其在 600 nm 波長處吸光度值（OD值），以未接種MRS肉湯作空白對照，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間及OD值，繪制生長曲線，以明確不同乳酸菌生長速率。

1.3.1.2 耐酸性測定

將生長速率較高的3種乳酸菌活化液，以1%接種量分別接種于不同 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5）的 MRS中，于37℃、150 r/min培養(yǎng)36 h后取樣，測定其在600 nm處的吸光度值，并以乳酸菌在未酸化MRS（pH6.0）中的生長情況作對比，考察3株乳酸菌耐酸特性。

1.3.2 工藝流程

黃精→挑選、稱重→粉碎過1.25 mm篩→黃精與山楂以不同質(zhì)量配比→浸泡→添加紅糖、混合打漿→酶解→100℃滅菌15 min→接種發(fā)酵→過濾→成品。

1.3.3 操作要點(diǎn)

1.3.3.1 浸泡

黃精、山楂以不同質(zhì)量配比后，于料液比1∶15（g/mL）、60℃下浸泡30 min。

1.3.3.2 打漿

浸泡后添加6.7%紅糖，混合打漿5 min。

1.3.3.3 酶解

將打漿后的基質(zhì)按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加4.5%復(fù)合酶（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為2∶1），于50℃下酶解60 min。

1.3.3.4 接種發(fā)酵

在接種發(fā)酵酵素過程中，最佳收集菌體時(shí)間為對數(shù)生長期末期，以此培養(yǎng)時(shí)間（20 h）收集菌體，按不同菌種體積比制備發(fā)酵菌液，進(jìn)行接種發(fā)酵。由于黃酮類物質(zhì)為黃精、山楂中重要的生物活性成分，并且感官品質(zhì)對產(chǎn)品具有重要意義。因此，優(yōu)化接種發(fā)酵工藝時(shí)，選取總黃酮含量及感官評分為綜合評價(jià)指標(biāo)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 菌種體積比對復(fù)合酵素品質(zhì)影響

采用黃精與山楂質(zhì)量比4∶1制備發(fā)酵基質(zhì)，以接種量4%、植物乳桿菌-類干酪乳桿菌體積比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4接種后，于 37℃靜置發(fā)酵48 h，測定其總黃酮含量、乳酸菌活菌數(shù)并進(jìn)行感官評價(jià)，確定最佳菌種體積比。

1.3.4.2 黃精與山楂質(zhì)量比對復(fù)合酵素品質(zhì)影響

固定其他條件，將黃精與山楂質(zhì)量比設(shè)置為7∶1、4∶1、1∶1、1 ∶4、1 ∶7，考察黃精與山楂質(zhì)量比對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響。

1.3.4.3 接種量對復(fù)合酵素品質(zhì)影響

固定其他條件，將接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%，考察接種量對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響。

1.3.4.4 發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素品質(zhì)影響

固定其他條件，將發(fā)酵溫度設(shè)置為25、29、33、37、

41℃，考察發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響。

1.3.4.5 發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素品質(zhì)影響

固定其他條件，將發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為12、24、36、48、60 h，考察發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取黃精與山楂質(zhì)量比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為因素，以感官評分與總黃酮含量的綜合評分（Y）為響應(yīng)值，各因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.6 復(fù)合酵素感官評價(jià)

參照QB/T 5323—2018《植物酵素》中對于食用植物酵素的感官要求和張麗華等采用的9分制評分法，邀請具有發(fā)酵及感官品評相關(guān)專業(yè)背景的10名同學(xué)（5男5女），分別對復(fù)合酵素色澤、滋味、香氣和組織形態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行評分，取其平均值，具體見表2。

表2 復(fù)合酵素感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of compound enzyme

1.3.7 基本理化指標(biāo)測定

采用3，5-二硝基水楊酸分光光度法測定還原糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為y=1.322 3x-0.058 8，R=0.999 7；參照 GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》測定總酸含量；利用酸度計(jì)測定pH值；利用折光儀在25℃下測定可溶性固形物，以°Brix 表示。

1.3.8 乳酸菌活菌數(shù)測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》測定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3.9 總黃酮含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定

采用NaNO-Al（NO）-NaOH比色法測定總黃酮含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為y=0.457 4x-0.013 4，R=0.999 9。參照 GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》測定SOD活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示數(shù)據(jù)，利用Origin 2019繪制圖形，Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面分析，IBM SPSS Statistics 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）以及最小顯著差數(shù)（least significant difference，LSD）、鄧肯多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳酸菌的篩選

2.1.1 不同乳酸菌生長性能分析

不同乳酸菌生長曲線見圖1。

圖1 不同乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of different lactic acid bacteria

由圖1可知，植物乳桿菌ACCC 11095、植物乳桿菌AS 1.2437和類干酪乳桿菌CICC 21019生長速率較快，沒有明顯延滯期，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，其中植物乳桿菌ACCC 11095總體生長速率最快，并且進(jìn)入穩(wěn)定期后菌體數(shù)量最高，于18 h時(shí)達(dá)到對數(shù)生長期末期，其次為植物乳桿菌AS 1.2437、類干酪乳桿菌CICC 21019，兩者分別于22、20 h達(dá)到對數(shù)生長期末期；干酪乳桿菌ATCC 334相對于其他菌株具有明顯的延滯期、對數(shù)期及穩(wěn)定期，但菌體濃度較低，于22 h進(jìn)入穩(wěn)定期；短乳桿菌GDMCC 1.288相較于其他菌株生長速率最慢，對數(shù)生長期最短且菌體濃度最低，于16 h進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，植物乳桿菌ACCC 11095、植物乳桿菌AS 1.2437和類干酪乳桿菌CICC 21019生長性能較好，可進(jìn)一步分析其耐酸特性。

2.1.2 不同乳酸菌耐酸特性分析

由于發(fā)酵基質(zhì)初始pH值較低（4.0左右），且發(fā)酵過程中乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，使得基質(zhì)在前期發(fā)酵中總酸含量迅速升高、pH值下降，抑制發(fā)酵菌株生長，從而影響產(chǎn)品最終品質(zhì)。因此，發(fā)酵菌株不僅需要具有良好的生長性能，還要具備較好的耐酸特性，有助于基質(zhì)正常發(fā)酵，保證產(chǎn)品品質(zhì)。不同乳酸菌耐酸曲線見圖2。

圖2 不同乳酸菌耐酸特性Fig.2 The acid resistance of different lactic acid bacteria

由圖2可知，3株乳酸菌在不同pH值條件下生長情況均受到不同程度影響，隨著pH值的降低，抑制效果顯著（P＜0.05）且逐漸增強(qiáng)。這與焦媛媛等在分離于水果發(fā)酵液等不同來源的6株乳酸菌進(jìn)行耐酸特性研究時(shí)所發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。在pH值由4.5降至3.0過程中，植物乳桿菌ACCC 11095生長趨勢近似直線下降，抑制作用最為顯著，而類干酪乳桿菌CICC 21019相較于其他兩株菌抑制作用最弱，耐酸特性最好，其次為植物乳桿菌AS 1.2437，并且在pH值低于4.0時(shí)，植物乳桿菌AS 1.2437和類干酪乳桿菌CICC 21019的菌株生物量高于植物乳桿菌ACCC 11095。因此，綜合考慮菌株耐酸特性及生長量等發(fā)酵潛力，選擇具有較好生長速率及耐酸性的植物乳桿菌AS 1.2437和類干酪乳桿菌CICC 21019作為發(fā)酵菌株。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 菌種體積比對復(fù)合酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同乳酸菌在發(fā)酵代謝特性、功能特性及生長性能等方面存在差異性，在利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，采用多種乳酸菌混合發(fā)酵，相較于單一乳酸菌發(fā)酵可有效減輕發(fā)酵產(chǎn)生的不良風(fēng)味，并且不同乳酸菌之間存在著協(xié)同發(fā)酵作用，因此，采用多種乳酸菌共同發(fā)酵對酵素品質(zhì)的提升具有重要意義。菌種體積比對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響見表3。

表3 菌種體積比對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響Table 3 Effect of strain volume ratio on the quality of compound enzyme

由表3可知，當(dāng)采用植物乳桿菌AS 1.2437與類干酪乳桿菌CICC 21019體積比在4∶1～2∶1之間發(fā)酵復(fù)合酵素時(shí)，所得復(fù)合酵素總黃酮含量差異不顯著。而后，當(dāng)菌種體積比在1∶1～1∶4時(shí)，復(fù)合酵素總黃酮含量顯著（P＜0.05）低于4∶1～2∶1。感官評分與乳酸菌活菌數(shù)在菌種體積比為2∶1時(shí)達(dá)到最大值，并與其他菌種體積比相比具有顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇植物乳桿菌AS 1.2437與類干酪乳桿菌CICC 21019體積比為2∶1作為最佳菌種體積比進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 黃精與山楂質(zhì)量比對復(fù)合酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

黃精與山楂質(zhì)量比對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 黃精與山楂質(zhì)量比對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Polygonatum sibiricum and hawthorn mass ratio on the quality of compound enzyme

由圖3可知，復(fù)合酵素總黃酮含量隨黃精占比的減?。?∶1～1∶7）而逐漸增加，而感官評分則呈先升高后下降的趨勢，于4∶1時(shí)達(dá)到最大值；由于黃精與山楂質(zhì)量比在1∶1～1∶7之間，總黃酮含量并無顯著差異，因此，選擇黃精與山楂質(zhì)量比 7∶1、4∶1、1∶1作為進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。

2.2.3 接種量對復(fù)合酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

接種量對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 接種量對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the quality of compound enzyme

由圖4可知，復(fù)合酵素總黃酮含量和感官評分隨著乳酸菌接種量的增大，均呈先升高后下降的趨勢，這主要是由于接種量低時(shí)發(fā)酵時(shí)間長，容易污染雜菌，影響產(chǎn)品風(fēng)味；而當(dāng)接種量過高時(shí)，發(fā)酵速度較快，不僅使產(chǎn)品過酸同時(shí)因乳酸菌正常代謝消耗的營養(yǎng)成分增多，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物減少。在接種量為4%時(shí)，感官評分達(dá)到最大值且與其他接種量具有顯著差異（P＜0.05），而在接種量6%時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大值，且與接種量4%之間沒有顯著差異，因此，選擇接種量2%、4%、6%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.2.4 發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of compound enzyme

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，復(fù)合酵素發(fā)酵速度較慢，總黃酮含量及感官評分均最低，當(dāng)溫度為33℃時(shí)，感官評分和總黃酮含量達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素感官評分的影響具有顯著差異（P＜0.05），在發(fā)酵溫度為33℃～37℃時(shí)復(fù)合酵素總黃酮含量變化不顯著。研究表明，適宜溫度范圍對微生物代謝活動(dòng)有著促進(jìn)作用，各種生化反應(yīng)活躍，有利于總黃酮等活性物質(zhì)釋放，而當(dāng)發(fā)酵溫度過高或過低時(shí)，均對菌體的正常生長代謝有一定抑制作用，造成發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)降低。因此，綜合考慮選擇發(fā)酵溫度29、33、37℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the quality of compound enzyme

由圖6可知，復(fù)合酵素總黃酮含量與感官評分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，均呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過短時(shí)，發(fā)酵不充分，導(dǎo)致復(fù)合酵素原料風(fēng)味較重，總體感官評分較低；隨著發(fā)酵時(shí)間延長，乳酸菌代謝促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)釋放，總黃酮含量逐漸增加，但隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長，發(fā)酵基質(zhì)中的黃酮類物質(zhì)可能因部分氧化等原因而呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，復(fù)合酵素感官評分與總黃酮含量均達(dá)到最大值。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間36、48、60 h為響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 優(yōu)化結(jié)果和方差分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，感官評分相較于總黃酮含量對復(fù)合酵素品質(zhì)貢獻(xiàn)大，故采用多指標(biāo)加權(quán)綜合評分法設(shè)置Box-Behnken試驗(yàn)響應(yīng)值，將總黃酮含量和感官評分的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為40%和60%，綜合評分（Y）=（總黃酮含量/復(fù)合酵素最高總黃酮含量）×40%+（感官評分/復(fù)合酵素最高感官評分）×60%，以優(yōu)化黃精山楂復(fù)合酵素最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，所得結(jié)果見表 4。試驗(yàn) 3、6、17、25、26 為 5 個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)，以估計(jì)試驗(yàn)誤差，其余24個(gè)為析因試驗(yàn)。

將表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到Y(jié)綜合評分與各因素之間的二次多元回歸方程Y=0.93+0.049A-0.018B+0.016C+0.023D+0.022AB+0.010AC+0.015AD-0.005BC-0.002 5BD-0.007 5CD-0.091A-0.065B-0.034C-0.042D。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

表5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression model

由表 5可知，模型的 F 值為 22.690，P＜0.000 1，該模型極顯著，失擬項(xiàng)F值為1.860，P值為0.288 5＞0.05，說明該模型失擬項(xiàng)不顯著，并且模型的相關(guān)系數(shù)R值為0.957 8，表明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況良好，模型調(diào)整系數(shù)R為0.915 6，表明91.56%的響應(yīng)值變化可通過該模型進(jìn)行解釋，可用于復(fù)合酵素發(fā)酵條件參數(shù)的理論預(yù)測?；貧w模型方差分析的顯著性檢驗(yàn)，可表明因素對響應(yīng)值的影響；F值的大小，可反映各因素對復(fù)合酵素發(fā)酵工藝的重要程度。因此，通過對回歸方程方差分析可知，一次項(xiàng)A、B、D 影響極顯著（P＜0.01），C 影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng) AB 影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng) A、B、C、D影響極顯著（P＜0.01），C影響顯著（P＜0.05），說明各因素對復(fù)合酵素品質(zhì)的影響不是簡單的線性關(guān)系；通過對F值大小的比較，各因素對復(fù)合酵素發(fā)酵工藝影響的排序?yàn)辄S精與山楂質(zhì)量比（A）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞接種量（B）＞發(fā)酵溫度（C）。

2.3.2 交互作用分析

等高線的形狀可直觀反映出各因素之間交互作用的顯著性大小，即當(dāng)?shù)雀呔€為橢圓形時(shí)，說明因素之間交互作用顯著，當(dāng)?shù)雀呔€為圓形時(shí)，說明交互作用不顯著。黃精與山楂質(zhì)量比和接種量交互作用對黃精山楂復(fù)合酵素綜合評分影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖7。

圖7 AB交互作用對總黃酮含量和感官評分的綜合評分影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the influence of the interaction of AB on the comprehensive score of total flavonoids content and sensory evaluation

由圖7可知，黃精與山楂質(zhì)量比和接種量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響具有顯著性（P＜0.05），這與表5中的結(jié)果一致。

2.3.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證與確定

對數(shù)據(jù)及回歸方程進(jìn)一步分析計(jì)算，預(yù)測復(fù)合酵素最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為黃精與山楂質(zhì)量比4.89∶1、接種量3.79%、發(fā)酵溫度34.01℃、發(fā)酵時(shí)間51.70 h，此條件下，復(fù)合酵素綜合評分達(dá)0.95?？紤]實(shí)際操作過程，將工藝參數(shù)修正為黃精與山楂質(zhì)量比5∶1、接種量4%、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間52 h，在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得結(jié)果為0.94±0.03，是預(yù)測值的98.95%，表明該模型對黃精山楂復(fù)合酵素發(fā)酵工藝參數(shù)的分析預(yù)測具有良好效果。

2.4 黃精山楂復(fù)合酵素發(fā)酵前后品質(zhì)變化分析

在酵素生產(chǎn)中，監(jiān)測其發(fā)酵過程中感官品質(zhì)、基本理化指標(biāo)及功能性成分的變化，如pH值、總酸含量、還原糖含量、乳酸菌活菌數(shù)、SOD活力及總黃酮含量等，對于反映微生物發(fā)酵代謝能力、酵素品質(zhì)以及發(fā)酵終點(diǎn)的判定等具有重要意義。采用優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝制備黃精山楂復(fù)合酵素，對其發(fā)酵前后各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定，以反映其品質(zhì)的變化，結(jié)果見表6。

表6 復(fù)合酵素發(fā)酵前后品質(zhì)的變化Table 6 Quality changes of compound enzyme before and after fermentation

由表6可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中起關(guān)鍵作用的乳酸菌，通過其發(fā)酵代謝作用將基質(zhì)中的糖類等物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成乳酸、蘋果酸等有機(jī)酸釋放于酵素之中，使得發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值、還原糖含量顯著降低（P＜0.05），總酸含量顯著升高（P＜0.05）。同時(shí)，產(chǎn)生的適宜糖酸比，賦予酵素產(chǎn)品柔和清爽的口感，與發(fā)酵前相比感官評分顯著升高（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中基質(zhì)糖酸比的動(dòng)態(tài)變化與發(fā)酵基質(zhì)、微生物種類、接種量及發(fā)酵時(shí)間等因素相關(guān)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，與初始發(fā)酵基質(zhì)相比SOD活力及總黃酮含量顯著增加（P＜0.05），其中SOD活力提高到2倍左右，乳酸菌活菌數(shù)也達(dá)到了3.42×10CFU/mL。研究表明發(fā)酵過程中形成的酸性環(huán)境，不僅對酵素風(fēng)味產(chǎn)生了積極影響，而且對代謝積累的酚類化合物、SOD等活性物質(zhì)也起到保護(hù)作用，并且發(fā)酵的乳酸菌大多為益生菌，其與活性物質(zhì)的共同攝入，可以促進(jìn)人體的健康。隨著發(fā)酵的結(jié)束，酵素產(chǎn)品品質(zhì)逐漸成熟，各項(xiàng)基本理化指標(biāo)均滿足QB/T 5323—2018《植物酵素》中的規(guī)定。

3 結(jié)論

通過分析植物乳桿菌ACCC 11095、植物乳桿菌AS 1.2437、類干酪乳桿菌CICC 21019、干酪乳桿菌ATCC 334和短乳桿菌GDMCC 1.288這5種乳酸菌的生長性能和耐酸特性，表明植物乳桿菌AS 1.2437和類干酪乳桿菌CICC 21019具有良好的發(fā)酵性能，可用于發(fā)酵黃精山楂復(fù)合酵素，采用單因素試驗(yàn)，以總黃酮含量、感官評分和活菌數(shù)為指標(biāo)，得出兩者體積比為2∶1時(shí)，復(fù)合酵素品質(zhì)較佳。

在植物乳桿菌AS 1.2437與類干酪乳桿菌CICC 21019體積比為2∶1條件下，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，所得復(fù)合酵素發(fā)酵最佳工藝條件為黃精與山楂質(zhì)量比5∶1、接種量4%、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間52 h，綜合評分達(dá)到0.94，是預(yù)測值的98.95%；與黃精山楂復(fù)合漿相比，復(fù)合酵素通過發(fā)酵，pH值、可溶性固形物及還原糖含量顯著降低（P＜0.05），感官評分、總酸含量、總黃酮含量及SOD活力顯著升高（P＜0.05），乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到了3.42×10CFU/mL。本試驗(yàn)為制備一種兼具良好風(fēng)味及營養(yǎng)保健功能的新型黃精山楂復(fù)合酵素產(chǎn)品提供了參考。

加工編輯：姚駿