三聯(lián)益生菌復(fù)合發(fā)酵枸杞泡騰片的工藝優(yōu)化及質(zhì)量檢測(cè)

李月嬋，操俊，莊林，王佳麗，張同存，詹永成，羅學(xué)剛*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；3.寧夏杞果兄弟生物科技有限公司，寧夏中衛(wèi) 755000）

枸杞子是茄科枸杞屬植物枸杞（Lycium barbarum L）的干燥果實(shí)。枸杞子作為常見的藥食同源食材，在我國(guó)已有2 000多年的食用歷史?！侗静菥V目》記載“枸杞能補(bǔ)腎潤(rùn)肺，生精益氣，此乃平補(bǔ)之藥，所謂精不足者補(bǔ)之以味也”。研究表明，枸杞含有豐富的枸杞多糖、甜菜堿、抗壞血酸及多種微量元素，具有抗衰老、抗腫瘤、降血脂、降血糖、降血尿酸等功效。但是，目前市面上現(xiàn)代化枸杞深加工產(chǎn)品的種類不夠豐富。

益生菌又稱有益菌，主要定植在人體的口腔、皮膚、陰道和腸道環(huán)境中。自第一株益生菌被成功分離以來，其賦予宿主的益生效果引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。而且，益生菌發(fā)酵在改善果蔬等食材風(fēng)味、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化與吸收等方面，同樣有著重要的作用。本課題組前期已對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，并建立了枸杞與胡蘿卜、牛乳等的復(fù)合發(fā)酵飲料等制備工藝。但發(fā)酵飲料在運(yùn)輸、銷售等過程中的冷鏈物流可導(dǎo)致總成本偏高，往往需要通過改善包裝方式或改變飲品形式等手段降低其儲(chǔ)運(yùn)成本。相對(duì)于液體飲料來說，固體飲料由于其體積小、易于運(yùn)輸與攜帶等特點(diǎn)，發(fā)展相當(dāng)迅速。

泡騰片是國(guó)內(nèi)外日益流行的一種較為新穎的片劑類型，內(nèi)含酸性和堿性泡騰劑，遇水崩解時(shí)即可發(fā)生泡騰反應(yīng)，生成大量二氧化碳?xì)怏w，形成澄清透明的溶液。由于泡騰片兼具固體飲料和液體飲料的優(yōu)點(diǎn)，體積小，便于保存和運(yùn)輸，適合現(xiàn)代化生活的快節(jié)奏，因此深受消費(fèi)者的青睞。然而，關(guān)于益生菌發(fā)酵枸杞泡騰片的研究，目前國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。為此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)三聯(lián)益生菌發(fā)酵后的枸杞原漿進(jìn)行冷凍干燥處理，結(jié)合感官評(píng)價(jià)優(yōu)化輔料組分，開發(fā)一種風(fēng)味獨(dú)特、口感優(yōu)良的發(fā)酵枸杞泡騰片，為其他藥食同源成分泡騰片的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）LTJ28、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）YR2-2：天津科技大學(xué)微生態(tài)與分子藥理研究室-80℃保存。

1.1.2 試劑

枸杞原漿（食品級(jí)）：寧夏杞果兄弟生物科技有限公司；碳酸氫鈉（分析純）：中英保健食品有限公司；檸檬酸（分析純）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；乳糖（分析純）：浙江一諾生物科技有限公司；甜菊糖苷（分析純）：曲阜香州甜菊制品有限公司；聚乙二醇6000、木糖醇（均為分析純）：天津泰進(jìn)科技有限公司；濃縮乳清蛋白（分析純）：天津市江天化工有限公司；殼寡糖（分析純）：廣州優(yōu)藍(lán)海洋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4R2204 CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16B型高速臺(tái)式離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；PSSJ-4V型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；HCB-900V型垂直層流潔凈工作臺(tái)：海爾集團(tuán)控股有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ公司；DGG-9070BD型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZP-9型旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)：廣州大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；SY-3D型片劑四用測(cè)定儀：上海黃海藥檢儀器有限公司。

1.3 發(fā)酵枸杞泡騰片的工藝優(yōu)化

1.3.1 工藝流程

制備工藝流程見圖1。

圖1 制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process flow diagram

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 發(fā)酵枸杞凍干粉的制備

按照前期研究的最優(yōu)發(fā)酵工藝和凍干工藝對(duì)枸杞原漿進(jìn)行預(yù)處理。發(fā)酵工藝條件為枸杞原漿和飲用水的液料比為7.9∶1（mL/mL）、接種量為4%（植物乳桿菌CGMCC8198的接種量為1%、乳酸片球菌LTJ28的接種量為1%、干酪乳桿菌YR2-2的接種量為2%）、發(fā)酵時(shí)間為7.49 h、發(fā)酵溫度為37℃。凍干保護(hù)劑由濃縮乳清蛋白粉、殼寡糖和木糖醇組成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、6%及1.5%。將發(fā)酵后的枸杞原漿加入4%的保護(hù)劑，經(jīng)-20℃預(yù)凍24 h，再經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)干燥12 h，過80目篩，即可得到發(fā)酵枸杞凍干粉。

1.3.2.2 制粒

參照楊梅等的研究并稍做調(diào)整，選擇檸檬酸做酸性泡騰劑、碳酸氫鈉做堿性泡騰劑、乳糖做填充劑，甜菊糖苷做矯味劑，飲用水做黏合劑、聚乙二醇6000做潤(rùn)滑劑。將凍干粉、矯味劑和填充劑分別與酸性泡騰劑和堿性泡騰劑混合制備軟材，軟材需滿足“手握成團(tuán)，輕壓即散”的標(biāo)準(zhǔn)。將酸性與堿性軟材分別過14目篩制備酸粒和堿粒，并于37℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干30 min。

1.3.2.3 壓片

將烘干后的酸粒和堿?；旌暇鶆?，加入適量潤(rùn)滑劑放置于旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)壓片成型。

1.3.3 發(fā)酵枸杞泡騰片的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

分別取5 g泡騰片樣品，加入25℃飲用水100 mL，待完全溶解后，由食品專業(yè)相關(guān)人員組成感官評(píng)定小組，分別從香氣、口感、狀態(tài)3個(gè)方面對(duì)泡騰片進(jìn)行評(píng)分，總分100分。泡騰片感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 泡騰片感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Effervescent tablet sensory evaluation criteria

1.3.4 發(fā)酵枸杞泡騰片制備的單因素試驗(yàn)

以填充劑含量7%、矯味劑含量3%、泡騰劑含量70%、泡騰劑酸堿質(zhì)量比1.2∶1為基礎(chǔ)條件，以矯味劑含量（1%、2%、3%、4%、5%）、泡騰劑含量（60%、65%、70%、75%、80%）、泡騰劑酸堿質(zhì)量比（0.8∶1、1.0∶1、1.2 ∶1、1.4 ∶1、1.6 ∶1）為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)因素對(duì)泡騰片感官品質(zhì)的影響。

1.3.5 發(fā)酵枸杞泡騰片制備的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

選取單因素試驗(yàn)確定的各因素的較優(yōu)值，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，采用Design-Expert.10響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)Box-Behnken Design中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，具體因素水平見表2。

表2 Box-Behnken Design因素水平Table 2 Box-Behnken Design level of form factors

1.4 發(fā)酵枸杞泡騰片的質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版中的檢測(cè)方法，對(duì)發(fā)酵枸杞泡騰片的外觀、崩解時(shí)間、pH值、重量差異、硬度和脆碎度6項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.1 外觀的測(cè)定

取若干泡騰片放置于手心內(nèi)，在自然光下以肉眼觀察片劑的外觀。

1.4.2 重量差異的測(cè)定

隨機(jī)選取6片泡騰片，稱量每片重量，再稱量總重量并計(jì)算平均值。

1.4.3 崩解時(shí)間的測(cè)定

對(duì)泡騰片崩解時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)抽取6片。

1.4.4 pH值的測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定泡騰片溶解后溶液的pH值，隨機(jī)抽取6片。

1.4.5 硬度的測(cè)定

利用片劑四用測(cè)定儀測(cè)定泡騰片硬度，隨機(jī)測(cè)定3片。

1.4.6 脆碎度的測(cè)定

利用片劑四用測(cè)定儀測(cè)定泡騰片脆碎度，隨機(jī)測(cè)定22片。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 7軟件、Design-Expert.10響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 矯味劑含量對(duì)發(fā)酵枸杞泡騰片的影響

甜菊糖苷是一種以甜菊干葉為原料的食品添加劑，具有甜度高、能量低等特點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于飲料、糕點(diǎn)等食品加工行業(yè)。不同含量的矯味劑對(duì)泡騰片感官評(píng)分的影響見圖2。

圖2 不同含量的矯味劑對(duì)泡騰片感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of different contents of flavoring agents on sensory scores of effervescent tablets

由圖2可知，隨著矯味劑含量的增加，感官評(píng)分先升高再降低，這說明一定量的矯味劑可增加飲料的甜味，過多則會(huì)造成風(fēng)味的不協(xié)調(diào)。當(dāng)矯味劑含量為3%時(shí)，該泡騰片飲料酸甜適中，口感最佳。因此，適宜的矯味劑含量為3%。

2.1.2 泡騰劑含量對(duì)發(fā)酵枸杞泡騰片的影響

泡騰劑用量決定了泡騰片的泡騰效果、口感、溶解性等性質(zhì)。當(dāng)泡騰劑含量過低時(shí)，往往達(dá)不到崩解時(shí)間的要求，且碳酸含量不足可造成整體風(fēng)味寡淡；泡騰劑過高又會(huì)有酸澀感，若pH值偏低也會(huì)影響口感。不同含量的泡騰劑對(duì)泡騰片感官評(píng)分的影響見圖3。

圖3 不同含量的泡騰劑對(duì)泡騰片感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of different contents of disintegrating agents on sensory scores of effervescent tablets

由圖3可知，隨著泡騰劑含量的增加，枸杞泡騰片的感官評(píng)分先升高后降低，在泡騰劑含量為70%時(shí)，泡騰片的感官評(píng)分最高，因此，適宜泡騰劑含量為70%。

2.1.3 泡騰劑酸堿質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵枸杞泡騰片的影響

泡騰劑包括一個(gè)酸性崩解劑和一個(gè)堿性崩解劑。由于檸檬酸成本較低，且酸味爽快可口，碳酸氫鈉溶解性較好，因此是目前應(yīng)用最廣泛的泡騰劑酸源和堿源。泡騰劑不同的酸堿質(zhì)量比對(duì)感官評(píng)分的影響見圖4。

圖4 不同的泡騰劑酸堿質(zhì)量比對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.4 Effects of acid-base mass ratio of different contents of disintegrating agents on the sensory scores

由圖4可知，當(dāng)檸檬酸與碳酸氫鈉質(zhì)量比為1.2∶1時(shí)感官評(píng)分高達(dá)53，隨著檸檬酸的增加感官評(píng)分急速下降，這可能是由于泡騰片水溶液過酸所致風(fēng)味變差。因此，泡騰劑酸堿質(zhì)量比為1.2∶1較為適宜。

2.2 發(fā)酵枸杞泡騰片的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

選取矯味劑含量、泡騰劑含量和泡騰劑酸堿質(zhì)量比為自變量，以感官評(píng)分為因變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

2.2.2 發(fā)酵枸杞泡騰片的感官評(píng)價(jià)模型的建立與分析

通過Design-Expert.10對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到發(fā)酵枸杞泡騰片感官評(píng)分與3個(gè)因素的多元二次回歸方程為Y=-1 843.55+79.575A+37.195B+838.25C+0.35AB-2.5AC-5BC-16.825A-0.233B-201.875C。模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Model regression coefficient significance test results

由表4可知，模型P＜0.000 1，差異高度顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，差異不顯著，相關(guān)系數(shù)R=0.994 8，表明該模型擬合程度較好，可以對(duì)該泡騰片工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。CV=2.34%，說明模型較可靠，SNR=28.871＞4，R=0.988 1，說明模型置信度較高。3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分影響的順序?yàn)锽>C>A。交互作用AB對(duì)感官評(píng)分影響顯著，交互作用BC對(duì)感官評(píng)分影響高度顯著；一次項(xiàng)B對(duì)感官評(píng)分的影響極顯著；二次項(xiàng)A、B、C對(duì)感官評(píng)分的影響高度顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過Design-Expert.10軟件對(duì)得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了該工藝條件的模型。在保證矯味劑含量、泡騰劑含量與泡騰劑酸堿質(zhì)量比這3個(gè)因素中一個(gè)因素不變的情況下，得到其他因素的三維響應(yīng)面曲線和等高線。不同因素之間的交互作用的響應(yīng)面曲線與等高線具體見圖5～圖7。

圖5 矯味劑含量和泡騰劑含量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent on sensory score

圖6 矯味劑含量和泡騰劑酸堿質(zhì)量比對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

圖7 泡騰劑含量及其酸堿質(zhì)量比對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the influence of effervescent and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

響應(yīng)曲面越陡以及等高線越密集，表明因素之間的交互作用越明顯。從圖5～圖7可以看出，交互作用為BC>AB>AC。說明泡騰劑含量和其酸堿質(zhì)量比的交互作用對(duì)泡騰片的感官評(píng)分影響最為顯著，而矯味劑含量與泡騰劑酸堿質(zhì)量比的交互作用對(duì)泡騰片的感官品質(zhì)影響相對(duì)較弱。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面分析得到最優(yōu)工藝條件為矯味劑含量為2.9%、泡騰劑含量為69.1%、泡騰劑酸堿質(zhì)量比為1.2∶1，在此條件下得到的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為66。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的感官評(píng)分平均值為66.5，與模型預(yù)測(cè)值接近，證明該模型可靠。由此工藝得到的發(fā)酵枸杞泡騰片溶解后酸甜可口，兼具枸杞的清香和乳酸風(fēng)味，為中試試驗(yàn)生產(chǎn)應(yīng)用提供了參考。

2.3 發(fā)酵枸杞泡騰片的質(zhì)量檢測(cè)

2.3.1 外觀的測(cè)定結(jié)果

泡騰片表面呈橙色且色澤均勻，外觀完整光潔，無斷裂、變形現(xiàn)象。

2.3.2 重量差異的測(cè)定結(jié)果

為了保證食品含量的準(zhǔn)確性，重量差異必須控制在制定范圍內(nèi)，才能確保泡騰片的品質(zhì)穩(wěn)定性。隨機(jī)檢測(cè)發(fā)酵枸杞泡騰片，片重均為0.33 g，表明該泡騰片在重量差異這項(xiàng)指標(biāo)上符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版內(nèi)的規(guī)定。

2.3.3 崩解時(shí)間的測(cè)定結(jié)果

泡騰片的崩解時(shí)間等指標(biāo)檢查結(jié)果見表5。

表5 泡騰片的崩解時(shí)間、pH值及硬度檢查結(jié)果Table 5 Disintegration time，pH value and hardness test results of effervescent tablets

泡騰片的崩解時(shí)間是泡騰片品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，崩解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響泡騰片的食用性。如表5所示，枸杞泡騰片的平均崩解時(shí)間為180.83 s，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)于泡騰片需要在5 min內(nèi)崩解的標(biāo)準(zhǔn)，且泡騰后水溶液澄清，無明顯顆粒殘留。

2.3.4 pH值的測(cè)定結(jié)果

取1片泡騰片投入100 mL飲用水中，待完全溶解后用pH計(jì)測(cè)定溶液的pH值。如表5所示，隨機(jī)測(cè)定6片枸杞泡騰片，pH值均在6以下，平均pH值為5.71，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%。表明該泡騰片溶解后是一種弱酸性飲料，不刺激消化道，適合老人和幼兒等腸胃弱的群體。

2.3.5 硬度的測(cè)定結(jié)果

片劑的硬度指片劑抵抗進(jìn)入其表面的硬物質(zhì)的能力，只有具有一定的硬度，才可以確保其在儲(chǔ)運(yùn)過程中完整無破損。如表5所示，枸杞泡騰片的平均硬度為14.5 N，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定。

2.3.6 脆碎度的測(cè)定結(jié)果

泡騰片的脆碎度檢查結(jié)果見表6。

表6 泡騰片的脆碎度檢查結(jié)果Table 6 Friability test results for effervescent tablets

如表6可知，枸杞泡騰片減失質(zhì)量比例小于1%，且用于檢測(cè)的泡騰片均無斷裂及粉碎情況，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)片劑脆碎度的要求。

3 結(jié)論

本研究首先通過單因素試驗(yàn)，基于發(fā)酵枸杞泡騰片的矯味劑含量、泡騰劑含量和泡騰劑酸堿質(zhì)量比這3個(gè)因素對(duì)其感官品質(zhì)進(jìn)行研究，并利用響應(yīng)面法進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立發(fā)酵枸杞泡騰片的二次多項(xiàng)式回歸方程。運(yùn)用該模型進(jìn)行最優(yōu)工藝條件預(yù)測(cè)，得到的最優(yōu)工藝條件為矯味劑含量為2.9%、泡騰劑含量為69.1%、泡騰劑酸堿質(zhì)量比為1.2∶1。在此條件下的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為66。對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分實(shí)際值為66.5，與預(yù)測(cè)值接近，因此該模型具有較強(qiáng)的科學(xué)性。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的方法，進(jìn)一步測(cè)定發(fā)酵枸杞泡騰片的外觀、崩解時(shí)間、pH值、重量差異、硬度和脆碎度，結(jié)果表明所制泡騰片均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定。按照本工藝生產(chǎn)的發(fā)酵枸杞泡騰片既有枸杞滋陰補(bǔ)腎和益生菌對(duì)于健康的系統(tǒng)性調(diào)理等功效，又具備泡騰片易溶易攜、能保持快速恢復(fù)液體產(chǎn)品品質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。此外，本品以甜菊糖苷做矯味劑，進(jìn)一步滿足了消費(fèi)者對(duì)于無糖健康食品的需求，具有廣闊的市場(chǎng)前景。