miRNA-451和鈣結(jié)合蛋白39在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)及臨床意義

程濤，李衛(wèi)陽，馬程遠(yuǎn)

南陽市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽 473000

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中常見的類型，約占所有肺癌的80%[1]。目前NSCLC的治療已經(jīng)有了重大進(jìn)展，但患者預(yù)后仍然不是十分理想，這主要是因?yàn)镹SCLC早期癥狀比較隱匿，很多患者確診時已發(fā)展至晚期，同時還伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。因此，早期診斷NSCLC十分重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRAN，miRNA）是轉(zhuǎn)錄后的一種調(diào)控因子，會抑制靶基因表達(dá)，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miRNA作為腫瘤抑制因子，有助于判定腫瘤患者預(yù)后[3]。鈣結(jié)合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39）是從黑斑息肉綜合征患者組織中分離得到的，目前已在前列腺癌和肝癌中證實(shí)其可作為一種新的生物標(biāo)志物。本研究通過檢測miRNA-451和CAB39在NSCLC患 者NSCLC組 織及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析其與患者臨床特征的關(guān)系，并探討miRNA-451和CAB39的表達(dá)對NSCLC患者預(yù)后的影響，以期為NSCLC患者的早期診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年1月南陽市第一人民醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為NSCLC，且術(shù)前未接受放療、化療等治療；②經(jīng)影像學(xué)檢查，臨床分期明確；③免疫組化染色效果好；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并心、肝、脾等器質(zhì)性疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入180例NSCLC患者。其中，男93例，女87例；≤60歲122例，＞60歲58例；腫瘤直徑：≤3 cm 108例，＞3 cm 72例；腫瘤部位：周圍型152例，中央型28例；病理類型：腺癌127例，鱗狀細(xì)胞癌53例；分化程度：低分化89例，高分化91例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移106例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例；臨床分期：Ⅰ~Ⅱ期117例，Ⅲ~Ⅳ期63例。收集患者的NSCLC組織180例和對應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤邊緣5 cm以上）180例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測miRNA-451相對表達(dá)量

取NSCLC組織和癌旁組織，采用二甲苯脫蠟，以100%、90%、80%、70%、50%濃度的乙醇梯度除去二甲苯。采用miRNA提取試劑盒提取miRNA，采用分光光度計(jì)對RNA進(jìn)行定量評估，質(zhì)量評估采用瓊脂糖凝膠電泳，采用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。反應(yīng)體系：1 ml cDNA，10 ml 2×PCR Master Mix，1 ml正向引物，1 ml反向引物，0.5 ml 10×SYBER Green，6.5 ml ddH2O。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，計(jì)算miRNA-451的相對表達(dá)量。miRNA-451正向引物5'-GATCAAGGGGTTTTGGCTTT-3'，反 向 引 物5'-GTTGTCCATGGGGACCTCTA-3'；U6正向 引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG-3'。采 用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-451相對表達(dá)量，測量3次取平均值。以miRNA-451的中位數(shù)為界，＜中位數(shù)為低表達(dá)，≥中位數(shù)為高表達(dá)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測CAB39表達(dá)情況

取NSCLC組織和癌旁組織，經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片貼于3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷處理的載玻片上，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidinperoxidase，SP）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度評估染色結(jié)果[4]。陽性細(xì)胞所占比例評分：＜5%為0分，5%~29%為1分，30%~69%為2分，≥70%為3分；染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，深黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例評分和染色強(qiáng)度評分相乘，0~3分為陰性，≥4分為陽性。

1.4 隨訪方法

采用電話和門診隨訪的方式隨訪3年，末次隨訪時間為2020年1月31日，統(tǒng)計(jì)生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸模型分析NSCLC患 者NSCLC組織 中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況的影響因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織和癌旁組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況的比較

NSCLC組織中miRNA-451相對表達(dá)量和CAB39陽性表達(dá)率均明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC組織和癌旁組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況的比較

2.2 NSCLC患 者NSCLC組 織 中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況影響因素的單因素分析

不同性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、分化程度NSCLC患 者NSCLC組 織 中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤直徑＞3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ~Ⅳ的NSCLC患者NSCLC組織中miRNA-451高表達(dá)率均低于腫瘤直徑≤3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ~Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.983、4.217、4.435，P＜0.05）。腫瘤直徑＞3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ~Ⅳ的NSCLC患者NSCLC組織中CAB39陽性表達(dá)率分別低于腫瘤直徑≤3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ~Ⅱ期的患 者，差 異 均 有統(tǒng) 計(jì)學(xué) 意義（χ2=4.916、5.268、17.207，P＜0.05）。（表2）

表2 NSCLC患者NSCLC組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況影響因素的單因素分析

2.3 NSCLC患 者NSCLC組 織 中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況影響因素的多因素分析

以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，以miRNA-451和CAB39表達(dá)情況作為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期均是NSCLC患者NSCLC組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。（表3、表4）

表3 NSCLC患者NSCLC組織中miRNA-451表達(dá)情況影響因素的多因素分析

表4 NSCLC患者NSCLC組織中CAB39表達(dá)情況影響因素的多因素分析

2.4 生存情況的比較

至隨訪截止時間，無失訪者。miRNA-451低表達(dá)患者的中位生存時間為21個月，短于miRNA-451高表達(dá)患者的25個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.743，P＜0.05）；CAB39陰性表達(dá)患者的中位生存時間為20個月，短于CAB39陽性表達(dá)患者的25個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.214，P＜0.05）。（圖1、圖2）

圖1 miRNA-451低表達(dá)（n=138）和miRNA-451高表達(dá)（n=42）NSCLC患者的生存曲線

圖2 CAB39陰性表達(dá)（n=115）和CAB39陽性表達(dá)（n=65）NSCLC患者的生存曲線

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，且呈逐年上升趨勢，其中NSCLC是肺癌中最常見的類型之一[5-7]。隨著醫(yī)療水平的不斷提升，NSCLC患者的治療取得了重大突破，生存時間明顯延長[8]。由于早期NSCLC患者的臨床癥狀較為隱匿，不容易被患者察覺，往往在確診時就已經(jīng)發(fā)展至中晚期，而且此時很多患者還伴隨浸潤和轉(zhuǎn)移，即使接受手術(shù)治療，其術(shù)后復(fù)發(fā)率也極高[9-10]。目前人們對肺癌發(fā)病機(jī)制以及細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等機(jī)制認(rèn)知不足，對患者的早期診斷及預(yù)后評估缺乏一定的根據(jù)[11-12]。因此，尋找有效的早期診斷及預(yù)后指標(biāo)至關(guān)重要。

miRNA-451位于染色體17q11.2，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為[13]。目前相關(guān)研究證實(shí)miRNA-451在膀胱癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌中具有抑癌作用，在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[14]。CAB39蛋白又稱小鼠蛋白25，目前關(guān)于其在惡性腫瘤發(fā)展中作用的研究較少，相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)CAB39在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)[4]。

本研究對180例NSCLC患者的NSCLC組織及癌旁組織進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miRNA-451相對表達(dá)量和CAB39陽性表達(dá)率均明顯低于癌旁組織，表明miRNA-451和CAB39可能抑制NSCLC的發(fā)生。進(jìn)一步分析miRNA-451、CAB39表達(dá)情況與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果表明，miRNA-451、CAB39表達(dá)情況與NSCLC患者的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，miRNA-451低表達(dá)和CAB39陰性有可能會促進(jìn)腫瘤生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15-16]。分析原因如下：miRNA能夠抑制致癌基因中巨噬細(xì)胞游走抑制因子以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，刺激腫瘤發(fā)生增殖、分化、浸潤等，而miRNA水平較低時，其調(diào)節(jié)能力相對較弱，因此腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移率較高[17-18]。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期均是NSCLC患者NSCLC組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)情況的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。此外，對180例患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-451低表達(dá)患者的中位生存時間短于miRNA-451高表達(dá)患者（P＜0.05），CAB39陰性表達(dá)患者的中位生存時間短于CAB39陽性表達(dá)患者（P＜0.05）。提示miRNA-451和CAB39對于評估NSCLC患者預(yù)后具有一定的應(yīng)用價值。分析原因如下：miRNA-451可調(diào)節(jié)耐藥基因的表達(dá)，從而提高患者藥物治療的敏感性，此外miRNA-451能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分化等，從而延長NSCLC患者的生存時間[19-20]。

綜上所述，NSCLC組織中miRNA-451和CAB39表達(dá)水平均明顯低于癌旁組織，miRNA-451低表達(dá)和CAB39陰性表達(dá)均可能會促進(jìn)腫瘤生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。但本研究也存在一定的局限性，樣本量較少，且為單中心研究，因此未來需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究。此外，目前關(guān)于CAB39影響NSCLC患者病情及預(yù)后的機(jī)制尚不明確，還可加強(qiáng)此方面的研究。