泛素蛋白D、CD133在胃癌組織中的表達及相關性分析

白艷麗，田笑笑，鄭玉峰

河南科技大學第一附屬醫(yī)院消化內科，河南 洛陽 471003

胃癌是全球范圍內常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高[1]。誘發(fā)胃癌發(fā)生的因素多種多樣，包括飲食因素、幽門螺桿菌感染、遺傳因素和癌前病變等，其中基因突變和外在性質改變的積累引起正常組織惡變是公認的胃癌發(fā)病原因[2]。腫瘤發(fā)生是一個長期的過程，隨著干細胞研究的深入，腫瘤干細胞學說為腫瘤的發(fā)生發(fā)展指明了新的研究方向，該學說的提出使學者意識到鑒別特異性細胞表面標志物的重要臨床意義[3]。CD133是一個單拷貝基因產(chǎn)物，由865個氨基酸組成，是五次跨膜結構的糖蛋白。臨床研究表明，CD133在胃腸道腫瘤細胞的浸潤和轉移中具有一定的調控作用，可能與降低腫瘤上皮-上皮間連接、分泌相關因子增加腫瘤細胞穿透細胞外基質的能力等因素有關[4-5]。泛素蛋白首次于1975年被發(fā)現(xiàn)，被認為是真核生物蛋白中最保守的蛋白之一，真核生物蛋白可通過與泛素蛋白結合對多種生理過程進行調控[6]。泛素蛋白D（ubiquitin protein D，UBD）被認為是一種致癌基因，已有研究證明UBD對腫瘤的復發(fā)和轉移有一定的促進作用[7]。本研究通過觀察UBD、CD133在胃癌組織中的表達，分析其在胃癌診斷中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2021年1月于河南科技大學第一附屬醫(yī)院行手術治療的胃癌患者的病歷資料。納入標準：①首次發(fā)現(xiàn)且未接受過相關治療；②收治前3個月未服用過抗生素、H2受體拮抗劑等相關藥物；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他胃腸道疾??；②收治前近3個月內進行過胃部或十二指腸手術；③合并其他類型的惡性腫瘤及肝腎功能異常。根據(jù)納入、排除標準，共納入102例胃癌患者，其中，男61例，女41例；年齡47~65歲，平均（56.76±4.98）歲。收集102例胃癌患者的胃癌組織標本及對應癌旁組織（距離病變部位＞3 cm）標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 UBD的免疫組化檢測 組織切片置于4℃冰箱過夜，并與初級抗體孵育，再置于37℃的環(huán)境下與辣根過氧化物二次孵育，時間為30 min，最后使用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）進行孵育，蘇木精復染檢測。

1.2.2 CD133的免疫組化檢測 試劑為兔抗人PKFD單克隆抗體、兔抗人CD133多克隆抗體、免疫印跡顯色劑、DAB顯色劑等。所有標本采用4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。取切片脫蠟和水化后，蒸餾水洗3次，每次2 min，后置于3%過氧化氫溶液中10 min，再次蒸餾水洗，以消除內源性過氧化氫酶，使用微波爐進行抗原修復，高火5 min，低火10 min后靜置30 min直至冷卻，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。蛋白封閉15 min棄血清，滴加稀釋好的一抗，置于4℃冰箱過夜，使用磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加生物素化二抗，孵育30 min，磷酸鹽緩沖液再次沖洗后滴加DAB顯色液，自來水充分沖洗，復染，鹽酸乙醇分化，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3 結果判定標準

以細胞質或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性細胞，在高倍鏡下隨機觀察5個視野，并根據(jù)陽性細胞百分比和染色強度進行半定量分析。UBD陽性細胞百分比計分：＜10%為0分，10%~25%為1分，26%~50%為2分，＞50%為3分；CD133陽性細胞百分比計分：＜5%為0分，5%~24%為1分，25%~49%為2分，50%~75%為3分，＞75%為4分；染色強度計分：無染色為0分，淡黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。UBD陽性判定：陽性細胞百分比計分與染色強度計分相加，0~1分為陰性，≥2分為陽性；CD133陽性判定：陽性細胞百分比計分與染色強度計分相乘，≥6分為陽性，＜6分為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關性檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UBD和CD133表達情況的比較

UBD、CD133在胃癌組織中的陽性表達率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 胃癌組織和癌旁組織中UBD和CD133表達情況的比較[n（%）]

2.2 UBD和CD133表達的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，UBD和CD133在胃癌組織中的表達呈正相關（r=0.613，P＜0.01）。

2.3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中UBD和CD133表達情況的比較

UBD、CD133陽性胃癌患者胃癌組織中腫瘤大小≥5 cm、腫瘤分期為T4b期、分化程度為低分化和有淋巴結轉移患者比例均高于UBD、CD133陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中UBD和CD133表達情況的比較

3 討論

近年來，隨著胃癌的一、二級預防工作的開展，早期胃癌的檢出率明顯提高，但大部分患者仍處于疾病中晚期。胃癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有較強的侵襲和轉移能力，這也是術后復發(fā)和患者死亡的主要原因[8]。因此尋找胃癌發(fā)生、發(fā)展的標志物是當前研究的重點，及早發(fā)現(xiàn)對改善患者預后具有重要臨床意義。相關研究指出，腫瘤細胞中部分細胞具有自我更新、分裂和分化能力，研究人員將其稱為腫瘤干細胞[9]。腫瘤干細胞理論將腫瘤的發(fā)生發(fā)展歸結為一小部分腫瘤干細胞，腫瘤干細胞是腫瘤不斷生長的根源[10]。近年來有研究證實，CD133為腫瘤干細胞的標志物，其在膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌等實體瘤中均有表達[11]。CD133主要分布于細胞突部分，在不同的腫瘤組織中表達不同[12]。早期報道稱，CD133在結直腸癌伴早期肝轉移患者中的表達水平明顯高于不伴肝轉移患者，因此可將其作為預測預后的有效指標[13]。UBD已被證實為重要的腫瘤調節(jié)蛋白，對細胞周期調控、靶蛋白修飾、染色體變異等細胞過程起重要作用[14-15]。UBD可調節(jié)細胞有絲分裂，縮短細胞周期，從而促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡[16-17]。已有研究表明，UBD的高表達可介導乳腺癌細胞干性表型改變，從而影響乳腺癌細胞的復發(fā)轉移[18]。

本研究結果顯示，UBD、CD133在胃癌組織中的陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），據(jù)此認為距離腫瘤組織越遠，UBD和CD133表達也會隨之逐漸減少，進而可通過檢測標本邊緣確認是否存在腫瘤組織殘留，可用于檢測手術的有效性。此外還可以通過了解UBD和CD133在癌旁組織中的表達情況判斷細胞分化程度，從而分辨腫瘤的良惡性，對指導治療方案和術后輔助治療也有重要作用[19-20]。本研究中，Spearman相關性分析結果顯示，UBD和CD133在胃癌組織中的表達呈正相關（r=0.613，P＜0.01），但UBD和CD133之間是否存在具體的調節(jié)通路，這需要在細胞分子水平進行深入探究。本研究中，UBD、CD133陽性胃癌患者胃癌組織中腫瘤大小≥5 cm、腫瘤分期為T4b期、分化程度為低分化和有淋巴結轉移患者比例均高于UBD、CD133陰性患者，這提示胃癌組織中UBD和CD133高表達可能與腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度和淋巴結轉移存在一定的關系。萬曉晨等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CD133表達與TNM分期和淋巴結轉移顯著相關，該蛋白及其下游信號通路雷帕霉素靶蛋白高表達對胃癌進展和腫瘤轉移具有協(xié)調作用，并提示腫瘤具有高度的侵襲和轉移潛能，但研究發(fā)現(xiàn)CD133表達與腫瘤的分化程度無關，這與本研究存在一定差異。目前關于CD133在胃癌中的研究仍處于起始階段，Attia等[22]指出CD133可能與腫瘤大小、組織學類型、TNM分期等存在著一定的關系，但這種關系是否具有顯著性也受患者的不同特征、遺傳學、種族、環(huán)境因素及不同評分法的影響，這可能是導致既往研究存在差異的原因。而在臨床研究中CD133表達影響胃癌的侵襲和轉移能力是較為被認同的，有研究發(fā)現(xiàn)CD133可能是介導了轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的人胃癌細胞中磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）信號通路的激活，從而促進腫瘤的侵襲和轉移[23]。關于UBD在胃癌中的研究報道極少，在Lozano-Pope等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在幽門螺桿菌感染影響Myd88基因轉錄譜異常小鼠模型中有1989個基因出現(xiàn)表達差異，包括UBD、鳥苷酸結合蛋白2、CD74等，研究指出這些基因可通過增強血管生成，細胞增殖、遷移、轉移和侵襲來促進胃癌進展，這也說明UBD表達與胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移等具有一定關系，但仍需要更多的臨床研究加以證實。由于本研究隨訪時間短，并不能明確兩者的表達水平與預后的關系。

綜上所述，胃癌組織中UBD和CD133蛋白表達均高于癌旁組織，兩者呈正相關，與腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度和淋巴結轉移情況均有一定聯(lián)系，是潛在的預后預測指標。