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    黃瓜誘變育種研究進(jìn)展

    2022-10-17 07:39:58吳則東李勝男
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年18期
    關(guān)鍵詞:突變體表型黃瓜

    陸 珂, 吳則東, 李勝男

    (黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院/黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150080)

    黃瓜(L.)是葫蘆科甜瓜屬的二倍體物種,也是世界主要蔬菜作物之一。黃瓜由于其清香脆甜的口感,深受人們的喜愛,是我國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)產(chǎn)量最高的蔬菜之一,一直是人們餐桌上的主要蔬菜。中國(guó)的黃瓜栽培歷史悠久,面積廣泛,2020年收獲面積為128.02萬hm,年產(chǎn)量達(dá)7.283×10t,占世界總量的56.61%和79.81%。盡管黃瓜的栽培面積和產(chǎn)量都很大,但是與葫蘆科的其他作物相比,它的基因組只有 367 Mbp,相對(duì)較小,遺傳基礎(chǔ)較狹窄,自然變異頻率低,變異率僅有3%~8%。經(jīng)過長(zhǎng)期的自然和人工選育,黃瓜品種間的遺傳差異越來越小,遺傳多樣性不足。依靠黃瓜的自發(fā)突變獲得優(yōu)良的遺傳材料,已無法滿足黃瓜功能基因組學(xué)研究的需要,導(dǎo)致黃瓜遺傳育種進(jìn)程緩慢。面對(duì)這樣的困難和瓶頸,開發(fā)新技術(shù),人為地創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)突變體,構(gòu)建優(yōu)異的種質(zhì)資源,加快黃瓜育種的進(jìn)程已成必然。

    誘變育種技術(shù)是指利用不同的物理或化學(xué)因素,人為地使植物體的組織發(fā)生變異,再通過選擇,育成抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高的新品種。誘變能引發(fā)基因突變,相比常規(guī)育種具有提高變異頻率、擴(kuò)大選擇譜、產(chǎn)生有益突變的優(yōu)點(diǎn),還能打破原有基因的連鎖,促進(jìn)遺傳重組,從而能在短時(shí)間內(nèi)獲得豐富突變體以育成新品種。目前在黃瓜誘變育種的研究領(lǐng)域中,國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要通過物理誘變、化學(xué)誘變的方法,使黃瓜產(chǎn)生大量的遺傳變異,促進(jìn)黃瓜功能基因組學(xué)的研究。

    本研究基于國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黃瓜的誘變育種的研究,對(duì)黃瓜突變體庫構(gòu)建的方法進(jìn)行歸納總結(jié),包括物理誘變、化學(xué)誘變、航天誘變及插入突變的方法,并探討了誘變技術(shù)對(duì)黃瓜性狀的影響以及鑒定方法,論述了黃瓜突變體在黃瓜育種進(jìn)程中的應(yīng)用,為黃瓜重要功能基因的挖掘以及新品種的選育奠定基礎(chǔ),提供重要的理論參考與借鑒。

    1 黃瓜突變體庫的構(gòu)建方法

    1.1 化學(xué)誘變

    化學(xué)誘變是指利用各種化學(xué)誘變劑使植物材料的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異,通過選擇,對(duì)突變體進(jìn)行培育,選育成新品種的方法?;瘜W(xué)誘變由于高效、使用方法簡(jiǎn)便并且成本較低,現(xiàn)如今被廣泛使用?;瘜W(xué)誘變劑是指能夠?qū)χ参矬w材料的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生作用,使其產(chǎn)生變異的化學(xué)物質(zhì)。目前,常用的化學(xué)誘變劑有四大類:

    (1)烷化機(jī)類,該類化學(xué)誘變劑使誘變劑內(nèi)一至多個(gè)活性烷基,通過烷化作用的方式,置換DNA分子結(jié)構(gòu)中的氫離子,從而導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程中DNA發(fā)生改變,進(jìn)而產(chǎn)生變異。常用的代表試劑有甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亞胺(EI)、硫酸二乙酯(DES)等。

    (2)核酸堿基類似物,因其具有與DNA堿基相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),在復(fù)制時(shí)能與DNA結(jié)合。在DNA復(fù)制的過程中進(jìn)入DNA結(jié)構(gòu)中充當(dāng)堿基,從而形成異種DNA,進(jìn)而導(dǎo)致堿基在配對(duì)時(shí)不按互補(bǔ)配對(duì)的原則配對(duì),發(fā)生錯(cuò)配,從而引起點(diǎn)突變。代表試劑有5-溴尿嘧啶(5-Bu)、5-氟尿嘧啶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BudR)等。

    (3)疊氮化鈉(NaN),是一種點(diǎn)突變劑,它可使正在進(jìn)行復(fù)制的DNA堿基發(fā)生替換,從而形成點(diǎn)突變。NaN具有高效安全、無毒、成本較低的特點(diǎn)。

    (4)其他化學(xué)誘變劑,如抗菌素、亞硝酸、羥胺等,雖然也能引起基因結(jié)構(gòu)突變,但在誘變育種中使用價(jià)值較低。

    其中,EMS以其簡(jiǎn)單方便、誘變頻率高的特點(diǎn),在黃瓜突變體庫的構(gòu)建中應(yīng)用較多。EMS誘變首先發(fā)生在DNA鳥嘌呤的N-7位置上,烷基取代氫離子后,成為一個(gè)帶正電荷的季銨基團(tuán),烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì),代替胞嘧啶,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變,從而使GC堿基對(duì)變異為AT堿基對(duì),EMS誘變遺傳物質(zhì)核酸有99%的概率是這種情況(圖1),可能產(chǎn)生無義突變、錯(cuò)義突變和沉默突變,這3種突變發(fā)生的頻率對(duì)突變體的篩選具有一定的指導(dǎo)意義。何書強(qiáng)利用1.6%EMS誘導(dǎo)華南型黃瓜高代自交系32X時(shí)間12 h,篩選出64種變異表型,包括植株矮化、3張子葉、真葉白化等典型突變體,其總變異率為28.19%。羅琳等利用0.5%、1.0%、2.0% EMS分別處理新泰密刺黃瓜,通過M0、M1代的比較分析,發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率隨EMS濃度的升高而下降,子葉葉面積和子葉葉綠素含量與對(duì)照相比明顯下降,然而真葉葉綠素含量顯著上升,分別比對(duì)照提高11.92%、19.13%、15.53%。

    1.2 物理誘變

    物理誘變是指利用各種理化因素使植物材料的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變異,通過選擇優(yōu)良單株,進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行培育,選育成新品種的方法。典型的物理誘變劑是不同種類的射線,主要的射線有X射線、射線、射線、射線、紫外線、離子束等。

    我國(guó)對(duì)于輻射誘變育種的研究最早開始于1957年,隨著我國(guó)科技高速發(fā)展,輻射誘變的發(fā)展也非常迅速,如今已廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種,其中,X射線和射線的應(yīng)用非常廣泛。其原理是電離輻射與植物體內(nèi)分子、原子核發(fā)生碰撞,直接或間接引起植物體內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變異,或者使遺傳物質(zhì)DNA斷裂再修復(fù),導(dǎo)致染色體產(chǎn)生斷裂、重排、缺失、倒位等變異,從而引起基因突變。蔡世娟等利用C輻射對(duì)自交系黃瓜18C-1進(jìn)行輻射誘變?cè)囼?yàn),低劑量(60 Gy)輻射減弱幼苗的光合作用和抗逆性,中、高劑量(80~120 Gy)輻射增強(qiáng)幼苗光合作用和抗逆性,C輻射對(duì)黃瓜光合色素各組分含量和光合基因表達(dá)量均產(chǎn)生影響。Palma等利用單色藍(lán)光、綠光、紅光和寬帶白光聯(lián)合紫外線輻射對(duì)黃瓜Lausanna RZ F種子進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)紫外線輻射通過基因依賴的方式來抵抗藍(lán)、紅、綠、白光對(duì)轉(zhuǎn)錄物積累的影響。胡尊瑞等利用冷等離子體模擬真空狀態(tài)處理黃瓜玉璽一號(hào)種子,發(fā)現(xiàn)最佳處理功率是80 W,種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均有提高,并且可以促進(jìn)黃瓜種子生根發(fā)芽,提早開花結(jié)實(shí)。但由于物理和化學(xué)誘變產(chǎn)生的突變密度較高,包含多個(gè)突變位點(diǎn),往往需要構(gòu)建突變表型分離群體,利用圖位克隆、定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(TILLING)等精確的篩選技術(shù)來篩選突變位點(diǎn),確定突變基因。

    1.3 太空誘變育種

    太空誘變育種,又稱太空育種、航天育種,是指通過返回式衛(wèi)星搭載植物種子或其他植物組織材料,利用太空環(huán)境中微重力、宇宙射線、高真空和交變磁場(chǎng)等物理因子,誘變植物材料發(fā)生變異,返回后通過栽培,從后代選擇優(yōu)良單株,進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行培育,選育成新品種的方法。西部航天育種基地和甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究所通過航天搭載,選育出了優(yōu)良變異白黃瓜品系05-33-6-1-2-49。潘連公等通過對(duì)航遺1號(hào)黃瓜進(jìn)行分子生物學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)航天誘變后的黃瓜種子變異豐富、穩(wěn)定快,發(fā)生了產(chǎn)量提高、口感好及耐儲(chǔ)存等有益變異。

    1.4 插入突變

    插入突變是指在植物基因組中隨機(jī)插入 T-DNA、轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等已知序列的元件,使其能夠影響或破環(huán)原有的基因結(jié)構(gòu),從而抑制插入位點(diǎn)基因功能的正常表達(dá)來創(chuàng)制突變體。T-DNA 插入通常為1~2個(gè)拷貝插入,雖然在受體基因組中的整合位置是隨機(jī)的,但插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列是唯一的,不會(huì)在基因組整合后發(fā)生轉(zhuǎn)座,具有高效表達(dá)和穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。因此,T-DNA 常被用作插入誘變劑來分離和克隆因插入而失活突變的基因。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)愈發(fā)成熟,T-DNA插入突變技術(shù)廣泛應(yīng)用于擬南芥和水稻突變體庫的構(gòu)建。

    1986年,Trulson等首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到黃瓜轉(zhuǎn)基因材料,在過去的幾十年里,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系做了大量研究,為T-DNA插入突變技術(shù)在黃瓜功能基因組學(xué)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。馮路路等利用基因作為黃瓜長(zhǎng)春密刺T-DNA插入片段創(chuàng)制突變體,并通過熒光顯微鏡與TAIL-PCR技術(shù)最終確定插入位點(diǎn)。李蕾等以黃瓜長(zhǎng)春密刺為植物材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,利用T-DNA插入突變體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植株,并采用PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法得到插入突變體14S1。但目前黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系仍然存在效率低和遺傳穩(wěn)定性差的問題,從而影響黃瓜 T-DNA 插入突變體的獲得。

    2 誘變技術(shù)對(duì)黃瓜性狀的影響

    2.1 表型性狀的影響

    通過物理和化學(xué)等技術(shù)誘導(dǎo)使黃瓜部分基因發(fā)生突變,有許多突變性狀會(huì)直接表現(xiàn)在表型上。薛存寶利用1.5%和2.0%EMS誘變歐洲溫室型黃瓜649品系,發(fā)現(xiàn)有64個(gè)表型有變化的突變體單株,突變頻率為15.2%,其突變性狀有矮化、短瓜、無花、葉緣失綠、葉片皺縮等。齊曉花等利用EMS誘導(dǎo)華北類型黃瓜YZ-01品系,得到了植株矮化、皺縮、圓葉、花瓣和花萼連體、少果刺等突變性狀(圖2)。Qian等利用UV-A和UV-B 2種紫外線輻射對(duì)黃瓜Hi Jack進(jìn)行輻照,發(fā)現(xiàn)UV-A的輻射可以使植株株型更加矮小、強(qiáng)壯。因此,表型鑒定是篩選差異性狀突變體最直觀的方法,可以利用表型突變的優(yōu)勢(shì),豐富突變體庫,從而為黃瓜基因功能分析和新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

    2.2 生理生化的影響

    不同的誘變技術(shù)不僅對(duì)黃瓜有表型性狀上的影響,在生理生化方面也會(huì)表現(xiàn)出與野生種不同的性狀。陳玉霞等利用Co-γ射線輻照黃瓜新品種新津春4號(hào)干種子,發(fā)現(xiàn)當(dāng)輻射劑量為100~1 000 Gy 時(shí),輻射處理對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)抑制明顯,并且黃瓜種子輻射誘變的半致死劑量是 795 Gy。Volkova等利用50、100、150、200 Gy劑量的Co-γ射線輻照黃瓜種子,發(fā)現(xiàn)50 Gy的低劑量輻射對(duì)黃瓜第4天的發(fā)芽狀況和苗長(zhǎng)影響最明顯,所以低劑量的Co-γ輻射能提高黃瓜種子早期的發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)。Liu等利用不同劑量的紫外線輻射UV-B對(duì)黃瓜9930進(jìn)行輻射,發(fā)現(xiàn)UV-B輻射可以有效抑制黃瓜幼苗的伸長(zhǎng)和降低黃瓜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量,其中3.33 μmol/(m·s)的UV-B有利于黃瓜幼苗在人工氣候箱中生長(zhǎng),還提高了黃瓜幼苗的抗氧化酶活性和抗壞血酸含量,從而提高黃瓜幼苗的抗逆性。因此,分析誘變后黃瓜生理生化水平的變化,可為黃瓜生長(zhǎng)提供理論依據(jù),為黃瓜突變體庫的構(gòu)建提供參考。

    2.3 分子水平的影響

    通過人為誘變技術(shù)對(duì)黃瓜幼苗代謝、光合作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等產(chǎn)生影響,可提高黃瓜的抗性。亓飛等通過對(duì)黃瓜EMS突變體庫中的長(zhǎng)春密刺進(jìn)行抗白粉病材料初篩, 然后進(jìn)行苗期生理鑒定和PCR分析,最終篩選出2份突變體材料Mu-86-2和Mu-58-9。獨(dú)角金內(nèi)酯(SLs類似物)可提高黃瓜對(duì)鹽脅迫的抗性,張小花對(duì)景潤(rùn)35號(hào)黃瓜品系外源噴施GR24(SLs類似物),發(fā)現(xiàn)外源GR24可以提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的光合作用,增強(qiáng)抗氧化酶活性和抗逆基因表達(dá),從而減輕黃瓜幼苗膜損傷,并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,探究了SLs誘導(dǎo)黃瓜幼苗耐鹽性的分子機(jī)制,為黃瓜溫室種植提供理論指導(dǎo)。蔣景龍等通過對(duì)春夏秋王黃瓜根系施加外源HS,發(fā)現(xiàn)HS能調(diào)節(jié)組織細(xì)胞在鹽脅迫下的氧化還原和離子平衡過程,減輕黃瓜膜損傷,從而緩解鹽脅迫引起的損傷,并利用高通量測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù),探究了HS誘導(dǎo)黃瓜幼苗耐鹽性的機(jī)理。因此,分析誘變黃瓜產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制,有助于研究抗性相關(guān)基因,為后續(xù)篩選抗性基因奠定基礎(chǔ)。

    3 黃瓜突變體鑒定方法

    3.1 表型鑒定

    通過對(duì)植株表型進(jìn)行觀察識(shí)別,對(duì)照野生型植株,直觀選擇出具有顯著變異的植株的方法。已經(jīng)獲得矮化植株、白化苗、株型矮湊等重要黃瓜突變體類型。薛紅霞等通過對(duì)華南型高代自交系6457進(jìn)行1.5% EMS處理10 h,構(gòu)建了黃瓜突變體庫,在M2代221個(gè)單株中發(fā)現(xiàn)了葉片卷曲、超級(jí)子房、花萼葉片化、矮化植株等性狀。賀欒勁芝等以EMS誘變?nèi)A南型黃瓜高代自交系6457得到的突變體M4代群體作為試驗(yàn)材料,通過表型觀察,發(fā)現(xiàn)了果實(shí)變長(zhǎng)、果實(shí)短筒等果實(shí)性狀突變體,總變異率達(dá)31.0%。Chen等利用1.6%EMS誘變黃瓜自交系WD1,獲得1個(gè)花和卷須突變體。Chen等利用1.5% EMS誘變北方生態(tài)型黃瓜自交系406種子12 h,通過表型觀察,發(fā)現(xiàn)了葉片、花器官和果實(shí)(圖3)等性狀的突變體,總變異率分別為33.6%、17.0%、26.9%。

    3.2 生物化學(xué)鑒定

    雖然表型性狀鑒定在黃瓜鑒定突變體方面被廣泛利用,但仍有點(diǎn)突變無法被鑒定出來,所以須要通過精確的篩選技術(shù)篩選出肉眼無法識(shí)別的變異類型。隨著黃瓜基因組測(cè)序的完成,TILLING技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在黃瓜育種研究中。TILLING技術(shù)是定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù),最早由美國(guó)Fred Hutchinson癌癥研究中心所創(chuàng)建,利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行突變體的篩選,獲得目標(biāo)基因的突變體,現(xiàn)主要用于鑒定突變株,在黃瓜突變體庫的鑒定、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源構(gòu)建、遺傳育種等方面都有廣泛的應(yīng)用。Berg等應(yīng)用TILLING技術(shù)在黃瓜突變?nèi)后w中篩選出7個(gè)由EMS誘變的基因的突變植株,還通過化學(xué)方法進(jìn)行生理指標(biāo)分析,鑒定出無法明確通過表型性狀鑒定的突變體。陳皓煒等利用聚乙二醇6000模仿干旱環(huán)境,通過氮藍(lán)四唑(NBT)還原法、硫代巴比妥酸法、酸性茚三酮法等方法進(jìn)行形態(tài)和生理指標(biāo)分析,篩選出11個(gè)耐旱突變植株。

    3.3 分子鑒定方法

    分子檢測(cè)技術(shù)是通過檢測(cè)基因存在、缺陷或表達(dá),對(duì)基因突變進(jìn)行遺傳差異鑒定和定向改進(jìn)。DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是應(yīng)用于黃瓜遺傳多樣性最廣泛的方法,具有快速、高效和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),主要有限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、ISSR(一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記)、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)等。其中ISSR、SCoT操作簡(jiǎn)單、成本低廉。 牛玉倩等通過EMS誘變得到黃瓜葉片白化突變體,通過簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)標(biāo)記法結(jié)合重測(cè)序結(jié)果開發(fā)的SNP和InDel標(biāo)記對(duì)其目標(biāo)基因進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)其位于黃瓜第7號(hào)染色體上約 66 kb 區(qū)間內(nèi)。趙子瑤利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了2個(gè)靶序列,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)sgDNA-Cas9-CsPID在黃瓜中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,PCR檢測(cè)出遺傳轉(zhuǎn)化率為1.7%、0.95%,但是并沒有發(fā)現(xiàn)突變體。韓杜斌利用藍(lán)光每天照射黃瓜津優(yōu)35號(hào)8 h,發(fā)現(xiàn)黃瓜體內(nèi)與煙粉虱抗性相關(guān)揮發(fā)物比對(duì)照上升,利用分子生物技術(shù),通過篩選和基因沉默處理,鑒定出基因調(diào)控脂氫過氧化物裂解酶,從而影響反式-2-己烯醛的合成,影響反式-2-己烯醛在黃瓜驅(qū)避煙粉虱中的作用。郭嘉華等通過層析和田間誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)篩選西芹腐根二次酮層物,利用篩選出的最強(qiáng)流分RRA102誘導(dǎo)處理黃瓜津春4號(hào)幼苗,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),西芹腐根二次酮層物誘導(dǎo)后能激發(fā)黃瓜幼苗的防御系統(tǒng),提高對(duì)枯萎病的抗性。

    4 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在黃瓜突變體庫中的應(yīng)用

    誘變育種的應(yīng)用主要體現(xiàn)在目標(biāo)性狀關(guān)鍵基因的定位與克隆和基因功能的解析,潘明等利用由EMS誘變的一個(gè)黃葉突變體,并通過圖位克隆方法與重測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)控制黃葉的突變基因,該突變基因通過調(diào)控植物體的光合作用從而導(dǎo)致黃葉形成。Yang等利用EMS誘變得到多個(gè)黃瓜毛狀體突變體,利用圖位克隆和BSA-seq相結(jié)合的方法將突變位點(diǎn)定位于6號(hào)染色體末端135.6 kb的區(qū)域內(nèi),通過遺傳分析發(fā)現(xiàn)無毛性狀是由隱性基因引起的。Chen等利用經(jīng)EMS誘導(dǎo)形成的黃瓜突變體庫中的花和卷須突變體,通過圖位克隆和MutMap法結(jié)合將基因定位于WD9Indel10和WD9SNP2之間124 kb的物理距離內(nèi),經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組分析表明參與黃瓜卷須和花器官原基的發(fā)育。遇瑤等從黃瓜突變體Tnt1突變體庫中發(fā)現(xiàn)黃葉突變體,利用圖位克隆法發(fā)現(xiàn)突變是影響黃葉的候選基因。Rong等利用EMS誘變得到2個(gè)卷葉突變體和,通過圖位克隆的方法發(fā)現(xiàn)基因是導(dǎo)致卷葉突變的基因。Hao等利用EMS誘變得到黃瓜黃綠色果皮突變體,通過MutMap和KASP基因分型的方法,發(fā)現(xiàn)是黃瓜突變體的致病基因。Song等利用EMS誘變得到黃瓜突變體,利用精細(xì)的遺傳作圖將突變位點(diǎn)定位在Indel53和Indel56之間大約86.3 kb的物理距離內(nèi),通過遺傳分析的方法鑒定出是致病基因。

    數(shù)量性狀易受外界環(huán)境影響,常有多個(gè)微效基因控制,所以數(shù)量性狀的基因的定位與克隆較質(zhì)量性狀相對(duì)較難,相關(guān)性狀的研究也不及質(zhì)量性狀深入。Wang等利用EMS誘變黃瓜CMCC得到1個(gè)種子萌發(fā)異常突變體,通過MutMap和KASP技術(shù)鑒定基因在黃瓜的萌發(fā)過程中具有一定的致死率。Hu等利用EMS誘變黃瓜自交系CMCC得到長(zhǎng)下胚軸突變體,該突變是由突變引起的,對(duì)黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的調(diào)控起重要的作用。王琛通過前期的EMS突變體庫構(gòu)建了根發(fā)育異常突變體,利用MutMap和KASP基因分型技術(shù),鑒定為黃瓜根發(fā)育異常的致病基因。黃瓜數(shù)量形狀的定位與克隆由于受多基因控制,構(gòu)建和鑒定過程困難,因此數(shù)量性狀的研究和解決這個(gè)問題的方法有待深入。

    5 問題及展望

    隨著研究的不斷深入,黃瓜誘變育種方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。但仍存在很多問題,如理化誘變產(chǎn)生的突變密度較高,篩選突變位點(diǎn)困難,并且在篩選突變體的過程中,由于表型觀察鑒定時(shí)效長(zhǎng),工作量大,易受外界環(huán)境影響,因此,容易遺漏一些非表型突變的性狀。黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系仍然存在效率低、穩(wěn)定性差的問題,從而影響黃瓜 T-DNA 插入突變體的獲得,阻礙黃瓜插入突變研究的進(jìn)展。

    如今,分子鑒定方法的應(yīng)用越來越廣泛,在基因定位與克隆等方面發(fā)揮重要的作用。然而由于數(shù)量性狀受環(huán)境影響大,鑒定較困難,所以在數(shù)量性狀方面的基因定位與克隆不夠深入。在今后的育種過程中,應(yīng)加強(qiáng)分子鑒定在誘變育種中的研究和應(yīng)用,加快技術(shù)創(chuàng)新以獲得更多的突變材料,不斷提高效率,為培育高品質(zhì)、抗性強(qiáng)的黃瓜新品種以及構(gòu)建種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

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