STAT3與環(huán)烷烴并噻吩類衍生物抑制劑的分子對接

高鴻雁，史麗穎，宋 昱，曹洪玉，于大永

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）家族包含7個(gè)成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6[1].STAT蛋白有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，即氨基末端結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和C端反式激活結(jié)構(gòu)域[2].STAT1、STAT3、STAT5在癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，其中STAT3最為活躍[3].STAT3是腫瘤免疫治療的一個(gè)熱門靶點(diǎn)，STAT3抑制劑不僅可以直接作用于腫瘤細(xì)胞抑制其生長和轉(zhuǎn)移，還可以調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境如炎癥、血管新生和腫瘤免疫等[4]，開發(fā)新型的特異性STAT3小分子抑制劑用來治療癌癥一直是學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)問題之一.

目前已報(bào)道的STAT3抑制劑有很多，其中作用機(jī)制清楚的STAT3抑制劑主要包括1，4-萘醌類[5]、喹啉類[6]、苯并[b]噻吩-1，1-二氧化物類衍生物[7]、氯硝柳胺衍生物[8]、水楊酸衍生物[9]等.已有多個(gè)STAT3抑制劑小分子進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，如氯硝柳胺、乙胺嘧啶、C188-9、BP-1-102等[10-11].SH2區(qū)域是STAT3蛋白中最為保守的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，對STAT3磷酸化二聚體的形成至關(guān)重要，直接作用于STAT3蛋白的SH2區(qū)域可阻斷STAT3的磷酸化、二聚化、核轉(zhuǎn)移以及STAT3靶基因的表達(dá).周文波[12]合成了一系列靶向STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域的2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類小分子抑制劑，將STAT3小分子抑制劑的活性提高了10倍左右.

本課題組前期對2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類小分子進(jìn)行了三維定量構(gòu)效關(guān)系的研究[13]，在此基礎(chǔ)上，本研究利用分子對接技術(shù)進(jìn)一步闡明了2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類小分子與STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的作用方式，為新型的靶向STAT3小分子抑制劑的設(shè)計(jì)開發(fā)提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 蛋白及小分子處理

從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB（http://www.rcsb.org/）搜索下載STAT3蛋白晶體結(jié)構(gòu)，PDB編號(hào)為6HJS.利 用Schr?dinger 2017軟 件 包 中 的Protein Preparation Wizard工具對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、去除水分子、補(bǔ)全不完整殘基、刪除多余蛋白構(gòu)象、分配相關(guān)電荷和能量最小化處理.從文獻(xiàn)[12]中獲取52個(gè)2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類小分子的化合物結(jié)構(gòu)，如圖1所示，通過ChemOffice軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)繪制并轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu).將小分子的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Schr?dinger 2017軟件包中，利用Ligprep工具添加OPLC_2005立場進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終得到能量最低的分子構(gòu)象，將其保存為.mol2格式.使用AutoDock和AutoDock Vina進(jìn)行分子對接時(shí)，借助OpenBabel程序?qū)⑿》肿拥?mol2格式轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式.

圖1 52個(gè)小分子化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the 52 small molecules

1.2 計(jì)算程序篩選

為了獲得準(zhǔn)確可靠的分子對接結(jié)果，分別運(yùn)用AutoDock、AutoDock Vina[14]、InsightⅡ中的CDOCKER（精準(zhǔn)分子對接）程序以及Schr?dinger 2017軟件中的Glide XP（精確對接）4種對接手段對STAT3與其共晶化合物進(jìn)行對接，根據(jù)對接后的小分子與原配體分子的均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）的大小，判斷對接程序與對接參數(shù)設(shè)置的合理性以及對該晶體復(fù)合物的適用性，一般認(rèn)為RMSD≤0.2 nm時(shí)能夠較好地重現(xiàn)原配體-受體的結(jié)合模式.最終篩選出最適合本研究的分子對接程序及方法.

1.3 分子對接

本研究中STAT3晶體結(jié)構(gòu)中的共晶化合物結(jié)合于STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域，因此采用配體擴(kuò)張法確定活性區(qū)域，即以原配體位置為中心向外擴(kuò)張一定的范圍生成對接盒子（docking box），此范圍內(nèi)的受體殘基就構(gòu)成了相關(guān)的活性位點(diǎn)，對接盒子的大小會(huì)影響對接結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性.對接盒子的中心設(shè)置為X=13.24，Y=54.43，Z=0.27，AutoDock中對接盒子大小設(shè)為5.6 nm×8.2 nm×6.2 nm，AutoDock Vina中設(shè)為2.06 nm×3.11 nm×2.31 nm，CDOCKER中對接盒子設(shè)為半徑2.0 nm的球體，Glide XP中對接盒子大小設(shè)為2.3 nm×3.1 nm×2.1 nm，圖2為Glide XP中生成的活性區(qū)域盒子.借助OpenBabel程序?qū)utoDock與AutoDock Vina產(chǎn)生的對接結(jié)果文件轉(zhuǎn)換為.pdb格式并導(dǎo)入Schr?dinger 2017軟件中，借助Pose viewer模塊分析對接構(gòu)象以及蛋白-小分子間的相互作用方式.Glide XP中，利用Ligand Docking工具對靶蛋白與小分子進(jìn)行對接，利用Ligand Docking模塊中的對接分?jǐn)?shù)（docking score）打分函數(shù)值用來評價(jià)小分子與靶蛋白的相互作用.

圖2 配體擴(kuò)張法生成的對接盒子Fig.2 Docking box generated by the ligand expansion method

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算程序篩選

本研究考察了AutoDock、AutoDockVina、CDOCKER和Glide XP這4種分子對接程序?qū)TAT3與其原配體對接的重現(xiàn)性，原配體構(gòu)象與對接后構(gòu)象的疊合圖如圖3所示，4種對接程序的RMSD值均小于0.2 nm，如表1所示.

由表1和圖3可知，使用4種程序進(jìn)行分子對接均具有良好的準(zhǔn)確度和可靠性，其中，Glide XP與AutoDock Vina的RMSD較低，Glide XP對接結(jié)果中配體分子在與STAT3蛋白的結(jié)合方式上與原配體更加類似，而且可提供更詳盡的對接信息，因此，后續(xù)選用Glide XP進(jìn)行分子對接研究.

圖3 原配體構(gòu)象與對接后構(gòu)象的疊合Fig.3 Superposition of the original ligand conformation and the docked conformation

表1 不同程序的分子對接結(jié)果Tab.1 Molecular docking results using different programm

2.2 分子對接

采用Glide XP程序?qū)TAT3蛋白與52個(gè)2-氨基-3-氰基噻吩衍生物小分子進(jìn)行分子對接，52個(gè)小分子的對接分?jǐn)?shù)如圖4所示.由圖4可知，所有小分子的對接分?jǐn)?shù)分布在-31.4～-22.6 kJ/mol之間，說明這些小分子均能較好地結(jié)合于STAT3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域，其中，小分子52#的對接分?jǐn)?shù)最低，為-31.4 kJ/mol，說明該分子的對接效果最好.

圖4 52個(gè)小分子的Glide XP對接分?jǐn)?shù)Fig.4 Glide XP docking scores of 52 small molecules

小分子52#能較好地進(jìn)入蛋白表面的活性空腔，但與原配體相比未能進(jìn)入側(cè)面空腔，如圖5所示，這也導(dǎo)致了小分子52#的對接分?jǐn)?shù)差于原配體的對接分?jǐn)?shù).這與小分子結(jié)構(gòu)的形狀和大小有關(guān)，因此在后續(xù)的藥物分子設(shè)計(jì)中，對小分子52#的構(gòu)象進(jìn)行合理改造，形成“橋梁”狀結(jié)構(gòu)也許有利于抑制劑活性的提升.

圖5 小分子52#和原配體與STAT3結(jié)合的蛋白空腔以及小分子52#的表面電勢分布Fig.5 Protein cavity of small molecule 52#and protoligand separatelybinding to STAT3 protein and the surface potential distribution diagram of small molecule 52#

2.3 互作模式分析

配體與受體的能量匹配包括靜電作用、氫鍵作用、范德華相互作用和疏水作用等，其中，靜電作用、氫鍵作用和范德華力控制藥物-受體結(jié)合，疏水作用是藥物-受體結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力.分析52個(gè)活性小分子與STAT3靶標(biāo)SH2結(jié)構(gòu)域的相互作用方式，發(fā)現(xiàn)氫鍵、極性疏水和靜電作用力為主要的作用方式.對接分?jǐn)?shù)排名前4位的小分子（52#、36#、31#、35#）與STAT3蛋白之間的互作模式如圖6所示，其中，小分子52#與氨基酸 殘 基Ser611、Glu612、Ser613形 成 氫 鍵 作 用，與Val637、Pro639、Trp623、Tyr657形 成 疏 水 作 用，與Lys591形成π-陽離子作用（π-cation），與Arg609、Glu612、Glu638、Lys591形成靜電作用，與Ser611、Ser613、Thr620、Ser636形成極性作用.

圖6 對接分?jǐn)?shù)排名前4位的小分子與STAT3蛋白之間的相互作用方式Fig.6 Interaction between STAT3 protein and small molecules in the top 4 docking scores

為了進(jìn)一步考察2-氨基-3-氰基噻吩衍生物抑制劑與STAT3蛋白SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，對52個(gè)活性分子與蛋白結(jié)合的每一種作用類型所涉及的氨基酸殘基進(jìn)行分析.總結(jié)SH2結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基與52個(gè)小分子發(fā)生相互作用的數(shù)目，結(jié)果如圖7所示；每一種相互作用類型中，能夠與某一氨基酸殘基發(fā)生作用的小分子數(shù)目如圖8所示.由圖7可知，Lys591、Arg609、Ser611、Glu612、Ser613這5個(gè)氨基酸參與的相互作用均在60次以上.由圖8可知，52個(gè)小分子與氨基酸Pro639均形成疏水作用，與氨基酸Glu638均形成靜電作用，只有1個(gè)分子沒有與氨基酸Val637形成疏水作用.另外，40個(gè)以上的小分子與氨基酸Lys591、Arg609、Glu612形成靜電作用，與Ser611、Ser613形成極性作用.

圖7 SH2結(jié)構(gòu)域的活性區(qū)域中氨基酸殘基與小分子發(fā)生相互作用的數(shù)目Fig.7 Number of interactions between amino acid residues and small molecules in the active region of the SH2 domain

圖8 不同作用類型中與氨基酸殘基發(fā)生作用的小分子數(shù)目Fig.8 Number of small molecules interacting with amino acid residues in different types of interaction

綜上所述，Lys591、Arg609、Ser611、Glu612、Ser613、Val637、Glu638、Pro639這8個(gè)氨基酸為2-氨基-3-氰基噻吩類衍生物與STAT3蛋白SH2結(jié)構(gòu)域相互作用的關(guān)鍵氨基酸.在52個(gè)小分子化合物中，具有良好的STAT3抑制活性的化合物結(jié)構(gòu)特征為：能夠與Arg609、Glu612、Ser613形成氫鍵作用，與Val637、Pro639形成疏水作用，與Lys591、Arg609、Glu612、Glu638形成靜電作用，與Ser611、Ser613形成極性作用.

3 討論與結(jié)論

STAT3是細(xì)胞增殖、存活和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在大多數(shù)人類癌癥中被組成性激活[15]，可以成為癌癥治療的重要潛在治療靶標(biāo)[16].目前臨床上的STAT3小分子抑制劑的活性大多處于微摩爾級，因此，開發(fā)新型高效的特異性STAT3小分子抑制劑至關(guān)重要.本研究以文獻(xiàn)[12]報(bào)道的52個(gè)新型的2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類STAT3靶向抑制劑為研究對象，基于分子對接技術(shù)探究了該類抑制劑與STAT3蛋白SH2結(jié)構(gòu)域的相互結(jié)合模式.結(jié)果表明，2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類抑制劑與STAT3有良好的親和力，氫鍵、疏水、π-cation、靜電以及極性作用為主要的相互作用方式.通過對小分子-受體結(jié)合區(qū)域涉及相互作用的氨基酸殘基進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Lys591、Arg609、Ser611、Glu612、Ser613、Val637、Glu638、Pro639這8個(gè)氨基酸為2-氨基-3-氰基噻吩類衍生物與STAT3蛋白SH2結(jié)構(gòu)域相互作用的關(guān)鍵氨基酸.另外，與STAT3晶體結(jié)構(gòu)中的原配體相比，對接效果最好的小分子52#雖然能較好地進(jìn)入蛋白表面的活性空腔，但受分子大小與形狀的影響，未能進(jìn)入側(cè)面空腔.因此，在未來對于新型2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類STAT3靶向抑制劑進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)時(shí)，增加分子大小使小分子形成“橋梁”狀結(jié)構(gòu)也許有利于活性的提升.與臨床藥物相比，2-氨基-3-氰基噻吩衍生物類小分子抑制劑雖然活性提高了10倍左右，但仍有很大的提升空間，后續(xù)可以借助計(jì)算機(jī)輔助藥物的手段設(shè)計(jì)新型的STAT3靶向小分子抑制劑并進(jìn)行生物活性驗(yàn)證，期望得到高效的特異性STAT3小分子抑制劑.