血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本分離膠促凝管聯(lián)合SDS前處理與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜應(yīng)用MALDI-TOF MS快速鑒定最佳時(shí)間探討

范 寧，段雪紅，楊 瑜，王媛媛，魚(yú)麗萍，謝立民，王 苗

（咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.神經(jīng)內(nèi)科，陜西咸陽(yáng) 712000）

血流感染（blood stream infection，BSI）是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，發(fā)病率較高，可導(dǎo)致機(jī)體多器官功能障礙，嚴(yán)重者發(fā)生休克甚至死亡[1]。血培養(yǎng)是BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，快速、準(zhǔn)確地確定病原菌信息，及時(shí)對(duì)癥用藥是臨床治療BSI的關(guān)鍵[2]。若在起病初期24～48h內(nèi)進(jìn)行有效地抗生素治療，可明顯降低BSI的病死率[3]。然而，目前的血培養(yǎng)檢驗(yàn)流程中，血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后，仍需36～48h才能得到最終的菌種鑒定報(bào)告[4]。近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix

assisted laser desorption ionization time of flight mass

spectrometry， MALDI-TOF MS）技術(shù)已應(yīng)用于血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的直接鑒定。但由于標(biāo)本前處理過(guò)程較復(fù)雜、不同菌種鑒定符合率有明顯差異，使其不能完全取代固體培養(yǎng)基的傳代培養(yǎng)。因此，本文針對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)，采用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)分離膠促凝管聯(lián)合十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）前處理標(biāo)本直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定相結(jié)合，探討血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中不同菌種快速鑒定的最佳時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年8月～2021年1月來(lái)源于咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院微生物室的243瓶血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本進(jìn)行分析。入選標(biāo)準(zhǔn)：BacT/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀發(fā)出陽(yáng)性報(bào)警，陽(yáng)性瓶經(jīng)常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢確認(rèn)為一種形態(tài)的細(xì)菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)瓶經(jīng)常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)多種形態(tài)細(xì)菌和/或真菌。如同一患者同時(shí)多瓶血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)，取最先報(bào)陽(yáng)的血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑 BacT/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀，VITEK MS微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，VITEK 2 Compact微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)BioMrrieux公司）；哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；血培養(yǎng)瓶，MS P96孔靶板和CHCA基質(zhì)液，甲酸和乙腈（法國(guó)BioMrrieux公司）；十二烷基硫酸鈉和乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；革蘭染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；分離膠促凝管（江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司）；大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國(guó)生物梅里埃公司提供。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)方法： BacT/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中的血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后，轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱平板，經(jīng)35 ℃，5ml/dl CO2環(huán)境培養(yǎng)24h，取純菌落，采用VITEK MS或VITEK 2 Compact鑒定，并以此結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較SDS前處理和固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定的符合率。

1.3.2 分離膠促凝管聯(lián)合SDS前處理后 MALDITOF MS直接鑒定：標(biāo)本前處理參照周春妹等[5]報(bào)道分離膠促凝管聯(lián)合SDS方法。MALDI-TOF MS鑒定按照VITEK MS操作程序進(jìn)行。

1.3.3 固相培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)生長(zhǎng)菌膜鑒定：取0.5ml血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板上密集劃線，置35 ℃，5ml/dl CO2環(huán)境培養(yǎng)。分別取2h，4h和6h培養(yǎng)的菌膜采用VITEK MS鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SDS前處理法直接鑒定和固體培養(yǎng)基短時(shí)菌膜鑒定符合率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定結(jié)果 見(jiàn)表1、表2。243例單一菌血培養(yǎng)標(biāo)本，經(jīng)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)鑒定，分別為23種革蘭陰性菌153株（62.96%）和21種革蘭陽(yáng)性菌90株（37.04%）。分離率前五位的細(xì)菌分別為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

表1 243例單數(shù)菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定結(jié)果

表2 各菌屬SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定結(jié)果及符合率[n（%）]

2.2 革蘭陽(yáng)性菌(G+菌)和革蘭陰性菌（G-菌)SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 見(jiàn)表3。革蘭陽(yáng)性菌中，SDS前處理法直接鑒定未鑒定出36株（40.00%，36/90），以葡萄球菌屬最多（30株），其中83.33%（25/30）為凝固酶陰性葡萄球菌。少見(jiàn)菌陰道加德納菌、藤黃微球菌、紋帶棒狀桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及溶血隱秘桿菌全部正確鑒定到種。

表3 G-菌和G+菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

革蘭陰性菌中，SDS前處理法直接鑒定錯(cuò)誤2株（1.31%，2/153），為克氏檸檬酸桿菌和惡臭假單胞菌各1株。3株聚團(tuán)泛菌鑒定結(jié)果較差，MALDITOF MS直接鑒定和6h菌膜分別鑒定正確1株；水生叢毛單胞菌僅6h生長(zhǎng)菌膜鑒定正確，惡臭假單胞菌6h生長(zhǎng)菌膜符合率為50%（1/2）；6株馬耳他布魯菌兩種鑒定方法均無(wú)結(jié)果，延長(zhǎng)培養(yǎng)至8h可正確鑒定到屬。

除6h培養(yǎng)菌膜外，SDS前處理法直接鑒定和2h，4h生長(zhǎng)菌膜鑒定，革蘭陰性菌符合率均高于革蘭陽(yáng)性菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.880～37.808，均P＜0.01）。

2.3 腸桿菌和非發(fā)酵菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 見(jiàn)表4。腸桿菌鑒定符合率均高于非發(fā)酵菌，僅4h培養(yǎng)菌膜鑒定比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.993，P＜0.05）,其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 腸桿菌和非發(fā)酵菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

2.4 主要革蘭陽(yáng)性菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 腸球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率比較見(jiàn)表5。金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌鑒定符合率比較見(jiàn)表6。金黃色葡萄球菌SDS前處理法直接鑒定和2h，4h生長(zhǎng)菌膜鑒定符合率均高于凝固酶陰性葡萄球菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.795，12.083, 9.035，均P＜0.01）。

表5 主要革蘭陽(yáng)性菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

表6 金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

3 討論

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是目前微生物實(shí)驗(yàn)室的常用工具，可顯著縮短病原菌的鑒定時(shí)間[6]。與傳統(tǒng)方法相比，通過(guò)MALDI-TOF MS從陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本中直接鑒定微生物，可明顯縮短鑒定時(shí)間[7]。此方法需要對(duì)樣品進(jìn)行濃縮和純化，包括離心和洗滌、選擇性裂解血細(xì)胞、血清分離或過(guò)濾等過(guò)程。目前，國(guó)外已有三個(gè)主要的商品試劑盒[8]用于血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的前處理。

雖然商品試劑盒易于標(biāo)準(zhǔn)化，但由于試劑盒成本高等原因，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室多采用自制試劑用于血液標(biāo)本的處理[2,5，9-12]。本研究參考周春妹等[5]分離膠管聯(lián)合SDS改良法處理標(biāo)本，采用MALDI-TOF MS直接鑒定，結(jié)果與文獻(xiàn)[5]比較，革蘭陽(yáng)性菌的符合率較低，其它結(jié)果基本一致。主要為凝固酶陰性葡萄球菌鑒定符合率低，這與侯偉偉等[2]的研究結(jié)果一致，高于方毅等[13]的結(jié)果?？偡下逝c分離膠管聯(lián)合Bruker質(zhì)譜直接鑒定[3,10,14]結(jié)果也一致。分離率前五位的細(xì)菌除表皮葡萄球菌外，其余四種菌直接鑒定符合率均大于70%，其中肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌為100%?？梢?jiàn)，采用自制試劑處理標(biāo)本，通過(guò)MALDI-TOF MS技術(shù)，可準(zhǔn)確鑒定血流感染的主要病原菌。

美國(guó)運(yùn)用溶解過(guò)濾法處理標(biāo)本，同時(shí)使用處理后過(guò)濾器上的細(xì)菌直接制備菌懸液，聯(lián)合VITEK 2 Compact進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，使得血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)到鑒定及藥敏試驗(yàn)的中位時(shí)間縮短至9.9h[15]。BROYER等[6]通過(guò)自動(dòng)化處理，實(shí)現(xiàn)了靶板制備的標(biāo)準(zhǔn)化，提高了種鑒定水平，同時(shí)可“按需”和“小批量”操作，節(jié)省了時(shí)間和人力。谷鈺峰等[16]將MALDITOF MS技術(shù)與流式細(xì)胞學(xué)聯(lián)合應(yīng)用于BSI病原體的快速鑒定及藥敏試驗(yàn)，使得報(bào)告時(shí)間更縮短至3h以內(nèi)。自動(dòng)化的標(biāo)本前處理操作，可顯著提高M(jìn)ALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的準(zhǔn)確率,聯(lián)合前處理純化菌液快速藥敏試驗(yàn)可為臨床抗感染治療提供更快更可靠的依據(jù)。

不同菌種，SDS前處理法MALDI-TOF MS直接鑒定的符合率存在差異?？偟膩?lái)說(shuō)，革蘭陰性菌高于革蘭陽(yáng)性菌，原因可能為血培養(yǎng)中革蘭陽(yáng)性菌污染概率大于革蘭陰性菌，而污染菌的菌量比較少，且革蘭陽(yáng)性菌有較厚的難被破壞的細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致VITEK MS直接法鑒定準(zhǔn)確率低[2]。凝固酶陰性葡萄球菌的鑒定符合率明顯低于金黃色葡萄球菌，對(duì)于二者具有一定的鑒別診斷意義[11]。HAMILTON等[17]研究結(jié)果顯示，對(duì)于血培養(yǎng)中未能直接鑒定的葡萄球菌，在低風(fēng)險(xiǎn)或低流行率地區(qū)，可排除金黃色葡萄球菌菌血癥。林曉暉等[18]利用VITEK MS 的 Launch pad 軟件對(duì)細(xì)菌所產(chǎn)生的質(zhì)譜峰質(zhì)荷比（M/Z）進(jìn)行分析，可快速鑒別甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)及 甲 氧 西 林 敏感的金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，為抗感染治療提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。

由于血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間不一致，批處理不能實(shí)現(xiàn)快速鑒定，單獨(dú)處理樣本相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。加之凝固酶陰性葡萄球菌、某些革蘭陰性菌及一些少見(jiàn)菌等，SDS前處理法直接鑒定效果不佳，故本研究同時(shí)利用MALDI-TOF MS鑒定血平板上短時(shí)生長(zhǎng)菌膜，以進(jìn)一步縮短陽(yáng)性血培養(yǎng)鑒定時(shí)間和鑒定符合率。

文獻(xiàn)[19]報(bào)道，血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的革蘭陰性桿菌采用MALDI-TOF MS成功鑒定菌種的平均時(shí)間僅為2.0h，而革蘭陽(yáng)性球菌為5.9h。本研究結(jié)果顯示，革蘭陰性菌2h菌膜鑒定符合率為59.48%，低于直接鑒定結(jié)果；而革蘭陽(yáng)性菌6h菌膜鑒定符合率達(dá)86.67%，高于直接鑒定結(jié)果。故對(duì)于革蘭陰性菌本研究結(jié)果直接鑒定效果更佳，而革蘭陽(yáng)性菌6h菌膜鑒定符合率更高。二者4h菌膜鑒定符合率與MALDI-TOF MS直接鑒定的數(shù)據(jù)接近，其中腸桿菌科細(xì)菌與金黃色葡萄球菌的鑒定符合率最高，非發(fā)酵菌低于腸桿菌，可能與其在固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)相對(duì)較慢有關(guān)。6h生長(zhǎng)菌膜與吳富煒等[20]的研究結(jié)果一致,高于HA等[21]的研究結(jié)果。周道紅等[22]報(bào)道革蘭陽(yáng)性菌4h菌膜與革蘭陰性菌2h菌膜鑒定結(jié)果均高于本研究，可能與病原菌數(shù)量及菌種分布有關(guān)。

相比于MALDI-TOF MS直接鑒定，固體培養(yǎng)基短時(shí)生長(zhǎng)菌膜質(zhì)譜鑒定不需要特殊試劑和標(biāo)本處理，可通過(guò)隨時(shí)查看培養(yǎng)基上菌膜生長(zhǎng)狀態(tài)即時(shí)鑒定，更適宜對(duì)單個(gè)或小批量樣本的鑒定。結(jié)合本研究結(jié)果及血液培養(yǎng)技術(shù)用于BSI診斷臨床實(shí)踐專家共識(shí)[23],本研究團(tuán)隊(duì)建議：①血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后首選MALDI-TOF MS直接鑒定，約85%的革蘭陰性菌及60%的革蘭陽(yáng)性菌可在1～2h內(nèi)被準(zhǔn)確鑒定到種；②對(duì)于鑒定失敗的革蘭陽(yáng)性球菌，直接選擇6h生長(zhǎng)菌膜進(jìn)行鑒定，因?yàn)?h和4h生長(zhǎng)菌膜鑒定符合率并不優(yōu)于直接鑒定。對(duì)于鑒定失敗的葡萄球菌，若本地區(qū)金黃色葡萄球菌BSI率較低，可提示臨床金黃色葡萄球菌感染的可能性不大。③對(duì)于未能進(jìn)行直接鑒定的標(biāo)本，革蘭陰性菌可選擇2h生長(zhǎng)菌膜進(jìn)行鑒定，如失敗再對(duì)4h生長(zhǎng)菌膜進(jìn)行鑒定。革蘭陽(yáng)性球菌則培養(yǎng)至4h鑒定，如失敗再對(duì)6h生長(zhǎng)菌膜進(jìn)行鑒定；④報(bào)陽(yáng)時(shí)長(zhǎng)大于2天且曲線平緩者建議直接選擇6h生長(zhǎng)菌膜鑒定，如報(bào)陽(yáng)曲線及涂片結(jié)果疑似布魯菌，則培養(yǎng)至8h再鑒定。

MALDI-TOF MS已被證明是一種快速、可靠的直接鑒定血培養(yǎng)瓶中病原體的方法[24]。本研究結(jié)果表明，MALDI-TOF MS技術(shù)可對(duì)BSI主要病原菌進(jìn)行快速直接鑒定，根據(jù)革蘭染色結(jié)果聯(lián)合固體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)生長(zhǎng)菌膜質(zhì)譜鑒定，可進(jìn)一步縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間，為臨床抗感染治療提供早期依據(jù)。