朗道血清質(zhì)控品作為ELISA法檢測血清可溶性ST2室內(nèi)質(zhì)控物的可行性探討

李全雙，許 靖，吳 燕，王書安，楊艷君（徐州市中心醫(yī)院/徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221006）

可溶性生長刺激表達(dá)基因2蛋白（soluble growth stimulation expressed gene 2 protein, sST2）作為臨床評價(jià)慢性心力衰竭患者預(yù)后的一種輔助手段，已在國內(nèi)多家醫(yī)院開展應(yīng)用[1-4]。目前臨床實(shí)驗(yàn)室測定sST2主要采用酶聯(lián)免疫技術(shù)，由于其手工操作步驟較多，因此在進(jìn)行檢測時(shí)，室內(nèi)質(zhì)量控制 (internal quality control, IQC)尤為重要。然而目前的IQC工作尚存在不足，如該試劑盒是進(jìn)口試劑盒，不配備質(zhì)控品，進(jìn)口的質(zhì)控品（重組人ST2凍干粉），價(jià)格較昂貴；且該進(jìn)口質(zhì)控品的有效期不足一年，與臨床生化項(xiàng)目所用的凍干粉質(zhì)控品如朗道血清質(zhì)控品（有效期四年）相比較，有效期較短；另外不同批號的進(jìn)口質(zhì)控品頻繁更換使用，不便于IQC工作開展。目前國內(nèi)尚未有sST2室內(nèi)質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室以方便IQC工作、簡單易行、節(jié)省成本為原則，探索了朗道血清質(zhì)控品作為sST2室內(nèi)質(zhì)控品的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 朗道人基質(zhì)血清定值質(zhì)控品（凍干粉）：中值Level 2，貨號：HN1530，批號：1326 UN，規(guī)格：5ml；高值Level3，貨號：HE1532，批號：1006UE，規(guī)格：5ml，均由英國朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：深圳匯松酶標(biāo)儀MB580，MM-2微量震蕩混合儀。

1.2.2 試劑：①sST2檢測試劑盒：貨號：BC-1065，批號：RN-61274, 規(guī)格：96T/盒，由Critical Diagnostics公司生產(chǎn)；②sST2進(jìn)口質(zhì)控品：貨號：BC-1066,批 號:RN-60733, 規(guī) 格：0.80ml，由Critical Diagnostics公司提供。

1.3 方法

1.3.1 朗道血清質(zhì)控品處理：按照操作說明復(fù)溶朗道中值Level 2和高值Level 3質(zhì)控品各一瓶，分別混合均勻，用無菌EP管各分裝100管，每管50μl，標(biāo)記后于-20℃保存。每次取出后室溫解凍30 min，待完全溶解，輕輕混勻后與樣本同步檢測。

1.3.2 sST2檢 測 方 法：sST2使 用 雙 抗 體 夾 心ELISA法測定，每個(gè)測試樣本用量為20μl。使用試劑盒提供的sST2標(biāo)準(zhǔn)濃度為400.0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，使用連續(xù)性倍比稀釋法，稀釋后sST2標(biāo)準(zhǔn)值濃度（ng/ml）分別是空白（0），S7（3.125），S6（6.25），S5（12.5），S4（25.0），S3（50.0），S2（100.0）和S1（200.0）。按照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔吸光度值(A)，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值與其對應(yīng)的濃度值進(jìn)行線性回歸擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)（r）。待測樣本和質(zhì)控品可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中根據(jù)其吸光度值來查找對應(yīng)的濃度值。

1.3.3 均勻性檢驗(yàn)：參照中國合格評定國家認(rèn)可委員發(fā)布的《CNAS-GL03能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南》[5],從分裝的中值Level 2和高值Level 3質(zhì)控品中隨機(jī)各抽取10管用于均勻性檢驗(yàn)，均按1～10編號，在重復(fù)條件下，檢測兩次。

1.3.4 穩(wěn)定性評價(jià)：隨機(jī)取中值Level 2和高值Level 3質(zhì)控品各6管，每管重復(fù)檢測2次，將所得均值作為初始均值。分別于第3，6，9，12個(gè)月隨機(jī)各抽取6管，按上述方法進(jìn)行檢測，分別取其均值，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)用Excel計(jì)算，成組t檢驗(yàn)和單因素方差分析用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sST2 ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及確定檢測的線性范圍 在3.125～200.0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間，按照標(biāo)準(zhǔn)品sST2的測定結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，r值為0.99，在200 ng/ml時(shí)未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，故線性范圍在3.125～200.0 ng/ml可以確認(rèn)是可靠的。

2.2 朗道血清質(zhì)控品中sST2 濃度的均勻性檢驗(yàn)見表 1。通過對中值和高值質(zhì)控品的兩次結(jié)果分別進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)值分別是1.932，0.519，P值分別是0.181，0.481，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，說明朗道質(zhì)控品分裝冷凍保存后均勻性很好。

表1 中值Level 2和高值Level 3分別檢測兩次的sST2結(jié)果（ng/ml）

2.3 朗道血清質(zhì)控品中 sST2 含量的穩(wěn)定性檢驗(yàn)見表 2。中值Level 2和高值Level 3中sST2的初始均值分別是20.03±1.23 ng/ml，22.01±2.04 ng/ml。第3，6，9，12個(gè)月的均值分別與初始月均值進(jìn)行t檢驗(yàn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，說明朗道血清質(zhì)控品中sST2 含量的穩(wěn)定性好。

表2 中值Level 2和高值Level3中初始月和其他月份均值結(jié)果（ng/ml）

3 討論

可溶性生長刺激表達(dá)基因2蛋白（sST2）是白介素1受體（IL-1R）的家族成員之一。當(dāng)sST2水平升高時(shí)，可與IL-33競爭性結(jié)合，使IL-33無法進(jìn)入心臟保護(hù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致心臟持續(xù)承壓，從而出現(xiàn)細(xì)胞死亡和組織纖維化。因此定量檢測sST2水平可以為臨床輔助性評估慢性心力衰竭提供一個(gè)相對精確的工具[6-8]。目前主要使用ELISA法測定sST2，該技術(shù)雖已成熟，但在實(shí)際操作中仍會受到人工操作、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等多因素的影響。該技術(shù)的IQC工作仍存在不足，質(zhì)控品尚未國產(chǎn)化，室間質(zhì)評（external quality assessment，EQA）工作也未統(tǒng)一開展。為了向臨床提供可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，開展好sST2檢測的室內(nèi)質(zhì)控工作，確保該檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性是臨床檢驗(yàn)的必然要求[9]110-111。

IQC是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系的重要組成部分。質(zhì)控品是做好IQC的重要工具。適宜的質(zhì)控品應(yīng)滿足以下要求：穩(wěn)定性好，有效期長，濃度符合檢測項(xiàng)目需求，質(zhì)控血清盡可能減少基質(zhì)效應(yīng)，反應(yīng)速率盡量與人血清一致，且價(jià)格適宜[10]。本實(shí)驗(yàn)室臨床生化常規(guī)項(xiàng)目使用的英國朗道公司生產(chǎn)的人基質(zhì)定值血清凍干粉，其基質(zhì)效應(yīng)小，有高低值，在4℃左右保存有效期可達(dá)四年，且價(jià)格適宜，國內(nèi)使用較為廣泛。缺點(diǎn)是在使用之前必須溶解，復(fù)溶后的血清穩(wěn)定時(shí)間短，必需分裝冷凍保存。朗道人基質(zhì)血清質(zhì)控品提供的項(xiàng)目中未見有sST2項(xiàng)目，本研究對其中值Level 2和高值Level 3中sST2的濃度進(jìn)行了探索。

本文參照中國合格評定國家認(rèn)可委員發(fā)布的《CNAS-GL03能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南》要求,對分裝保存的朗道質(zhì)控品進(jìn)行sST2濃度的均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)，結(jié)果顯示，在分裝冷凍保存的中值Level 2和高值Level 3中，sST2濃度瓶間差異小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明分裝冷凍保存的朗道質(zhì)控品中sST2均勻性好；經(jīng)過一年的冷凍保存瓶間差異小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明穩(wěn)定性至少在12個(gè)月，能夠滿足檢測要求。臨床關(guān)心檢測項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平濃度的檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室更關(guān)心的是檢測系統(tǒng)性能的質(zhì)量。檢測中只做1個(gè)水平的質(zhì)控品，反應(yīng)的質(zhì)量是整個(gè)可報(bào)告范圍的一個(gè)點(diǎn)，若能同時(shí)做2個(gè)或者更多水平的質(zhì)控品，反應(yīng)的質(zhì)量是一個(gè)范圍，質(zhì)控的效果更好，因此在選擇質(zhì)控品時(shí)，應(yīng)該有幾個(gè)濃度且濃度分布較寬，最好接近該項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平[9]229-238，[10]。在朗道中值Level 2和高值Level 3中sST2的初始均值分別是20.03 ng/ml，22.01 ng/ml。本試劑盒sST2在3.125～200.0 ng/ml范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線中的r值為0.99，在200 ng/ml時(shí)未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，故線性范圍在3.125～200.0 ng/ml可以確認(rèn)是可靠的。本試劑盒推薦的正常參考范圍小于35.0 ng/ml，因此中值Level 2，高值Level 3均可作為sST2低值質(zhì)控品，可以監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)曲線中sST2標(biāo)準(zhǔn)值S4(25 ng/ml)位點(diǎn)附近的檢測質(zhì)量。

下一步我們將利用檢測剩余的患者血清樣本自制sST2高值質(zhì)控品，進(jìn)一步探討其應(yīng)用的可行性，據(jù)此研究結(jié)果，逐步替代sST2的進(jìn)口質(zhì)控品。另外，我們將繼續(xù)探討sST2參考范圍[11]，確定本實(shí)驗(yàn)室的參考值。本研究能夠?yàn)殚_展sST2的臨床實(shí)驗(yàn)室在IQC和EQA工作方面提供重要參考。