川崎病患兒血清酸性鞘磷脂酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶水平和炎癥因子表達的相關(guān)性以及與免疫球蛋白治療效果的關(guān)系研究

張俊民，許愛平，趙利平，代寶春，張 娟（邯鄲市中心醫(yī)院兒科，河北邯鄲 056000)

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種不明原因?qū)е碌募毙?、自限性、發(fā)熱性、系統(tǒng)性血管炎癥，約20%～25%未經(jīng)治療的 KD 患兒會發(fā)生冠狀動脈病變[1]。靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）能調(diào)節(jié)免疫功能，抑制全身炎癥反應(yīng)，是KD治療的一線用藥，可降低冠狀動脈瘤發(fā)生率[2]，但是IVIG治療反應(yīng)性個體差異較大，部分患兒對IVIG治療無反應(yīng)?，F(xiàn)有觀點認為免疫系統(tǒng)異常激活、過度炎癥反應(yīng)可能與IVIG治療無反應(yīng)有關(guān)[3]。酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）是一種溶酶體糖蛋白，可將鞘磷脂水解為神經(jīng)酰胺，ASM 激活與細胞應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及血管內(nèi)皮功能障礙有關(guān)[4]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）是一種由鈣激活的蛋白磷酸酶，激活后會觸發(fā)鈣信號通路，上調(diào)炎癥細胞因子表達，CaN水平升高與冠狀動脈炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]。為了解血清ASM，CaN與KD的關(guān)系以及在KD中的臨床應(yīng)用價值，本研究擬檢測KD患兒血清ASM，CaN水平，分析其與KD患兒炎癥反應(yīng)和IVIG治療效果的關(guān)系，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年2月～2020年3月邯鄲市中心醫(yī)院收治的196例KD患兒（KD組），男性123例，女性73例，年齡3～6（4.85±0.49）歲；體重11～28（18.80±6.41）kg；發(fā)熱時間2天～15天，平均5.69±2.19天。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《川崎病的診斷、治療和長期管理:來自美國心臟協(xié)會的健康專業(yè)人員的科學(xué)聲明》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②初次診斷為KD，處于急性期；③均發(fā)病10天內(nèi)接受IVIG聯(lián)合阿司匹林治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性KD；②入組前已經(jīng)接受IVIG治療；③對IVIG治療過敏者。另選擇同期于我院進行體檢的198例健康兒童為對照組，男性131例，女性67例，年齡4～6（4.90±0.42）歲，體重13～30（19.63±6.71）

kg；均排除先天性心臟病、遺傳病、急慢性感染。KD組和對照組兒童監(jiān)護人均知情同意本研究且簽署同意書，兩組性別、年齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗所用試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；AU5800全自動生化分析儀，DxH800血細胞分析儀，DxH800血細胞分析儀（美國貝克曼公司）；Roller 20 MicroTEST1全自動血沉儀（意大利ALIFAX公司）；iE Elite 四維心血管彩超儀（荷蘭飛利浦公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗室檢測：于KD患兒入院當(dāng)日（對照組體檢當(dāng)日清晨）采集靜脈血標(biāo)本7ml，分裝為3管。其中一管（3ml）室溫下靜置30min，離心（室溫，3 000r/min，半徑10cm）10min分離血清上機檢測，當(dāng)日未完成檢測的樣本-80℃保存。采用Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀運用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清ASM，CaN，白細胞介素（interleukin，IL）-2，白細胞介素（interleukin，IL）-6，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，AU5800全自動生化分析儀檢測血清清蛋白（albumins，Alb），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平。另一管（2ml）注入EDTA抗凝試管，不經(jīng)離心處理，采用DxH800血細胞分析儀檢測中性粒細胞比例、白細胞計數(shù)（white blood cell count，WBC）、血小板（blood platelet count，PLT）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）。第三管（2ml）注入含3.2g/dl枸櫞酸鈉試管，Roller 20 MicroTEST1全自動血沉儀采用魏氏法測定紅細胞沉降率。所有試劑盒批內(nèi)和批間變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。飛利浦iE Elite 四維心血管彩超儀測量左冠狀動脈主干和右冠狀動脈內(nèi)徑，測量3次，取平均值，根據(jù)公式計算冠狀動脈Z值，Z值=[In冠狀動脈實測值（cm）- β1- β2×In體表面積（m2）]/均方誤差值，β1，β2為冠狀動脈的系數(shù)[7]。彩超由我院超聲醫(yī)學(xué)科2名10年以上工作經(jīng)驗的超聲醫(yī)師操作完成。

1.3.2 臨床治療：KD患兒入組后均給口服阿司匹林腸溶片（Bayer Vital GmbH，規(guī)格100mg/片，批準(zhǔn)文號H20130339）30～50mg/kg/d，單次靜脈滴注人免疫球蛋白(pH4)[（國藥準(zhǔn)字S20023011，國藥集團上海血液制品有限公司，規(guī)格2.5g(50ml)/瓶]2g/kg/d治療?；純后w溫恢復(fù)正常3天后或病程14天后，阿司匹林腸溶片劑量逐漸減至3～5mg/kg/d，6～8周且冠狀動脈恢復(fù)正常后停用。

1.3.3 IVIG治療反應(yīng)性判定：初次IVIG治療后仍持續(xù)發(fā)熱36h或以上，或者再度發(fā)熱歸為IVIG無反應(yīng)組（31例），體溫恢復(fù)正常者歸為IVIG反應(yīng)組（165例）[6]。

1.4 統(tǒng) 計 學(xué) 分 析 SPSS 25.0進 行 數(shù) 據(jù) 分 析。計量資料均符合正態(tài)分布，僅少量有輕微偏態(tài)（Kolmogorov-Smirnov法檢驗），以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對或成組t檢驗(含校正t檢驗)。計數(shù)資料以[n(%)]表示采用χ2檢驗。ASM，CaN與IL-2，CRP，IL-6，TNF-α之間相關(guān)性采用Pearson檢驗。多因素Logistic回歸分析KD患兒IVIG治療效果的影響因素。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 KD組與對照組血清ASM，CaN及炎癥因子水平比較 見表1。KD組患兒血清ASM，CaN，IL-2，CRP，IL-6和TNF-α水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 KD組與對照組血清ASM，CaN及炎癥因子水平比較（±s）

表1 KD組與對照組血清ASM，CaN及炎癥因子水平比較（±s）

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2.2 血清ASM，CaN水平與炎癥因子的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示：血清ASM，CaN水平與IL-2，CRP，IL-6，TNF-α水平均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（rASM=0.482, 0.521, 0.479, 0.396,rCaN=0.342, 0.512, 0.465, 0.485, 均P＜0.05）。

2.3 IVIG治療效果影響因素的單因素分析 見表2。IVIG反應(yīng)組血清ASM，CaN，CRP，IL-6水平、發(fā)熱時間、中性粒細胞比例、白細胞計數(shù)均低于IVIG無反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.969～18.252，均P＜0.05）；兩組年齡、性別、體重、血小板、血紅蛋白、紅細胞沉降率、清蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、左冠狀動脈主干Z值、右冠狀動脈冠脈Z值、IL-2，TNF-α比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 IVIG治療效果影響因素的單因素分析

2.4 IVIG治療效果影響因素的多因素Logistic回歸分析 回歸設(shè)計：建立非條件Logistic回歸模型，以本研究KD患兒資料為樣本，以IVIG治療效果為因變量，以前述單因素分析中P＜0.10的指標(biāo)為自變量，為提高統(tǒng)計效率并使回歸結(jié)果清晰，也考慮到陽性樣本量較少，將部分為連續(xù)數(shù)值的自變量，按兩組總均值進行分段（分層），轉(zhuǎn)化成兩分類變量。各變量賦值均盡可能咨詢專業(yè)統(tǒng)計人員，參考應(yīng)變量危險方向進行賦值，見表3?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結(jié)果：ASM，CaN，CRP均是KD患兒IVIG治療效果的影響因素（P＜0.05），見表4。

表3 賦值設(shè)計

表4 IVIG治療效果影響因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

川崎?。↘D）是一種急性發(fā)熱性全身性血管炎，其發(fā)病機制尚不清楚，一般認為是遺傳因素、感染和免疫等多種因素經(jīng)過復(fù)雜相互作用的結(jié)果，其主要病理基礎(chǔ)為全身脈管系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，大量巨噬細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞浸潤，激活免疫球蛋白、炎性因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞因子，驅(qū)使白細胞、粒細胞遷移浸潤于血管炎癥部位，引起脈管炎癥癥狀[8-9]。多數(shù)KD患兒病程呈自限性，但隨著KD進展，其會導(dǎo)致冠狀動脈瘤和血栓栓塞等嚴重并發(fā)癥，因此需要早期診斷和控制疾病進展。目前控制炎癥反應(yīng)是治療KD的關(guān)鍵，IVIG作為治療KD的一線用藥，多數(shù)患兒經(jīng)靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）治療后可退熱，但仍有10%～20%患兒對IVIG治療無反應(yīng)[10]，需要額外的抗炎治療。IVIG治療無反應(yīng)可增加冠狀動脈損傷風(fēng)險，導(dǎo)致青少年時期早發(fā)動脈粥樣硬化、心肌梗死[11]?，F(xiàn)有研究顯示過度炎癥反應(yīng)是IVIG治療無反應(yīng)的危險因素[12]。因此探討與KD炎癥反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，有助于評估KD患兒IVIG治療效果。

酸性鞘磷脂酶（ASM）是鞘脂類代謝的關(guān)鍵酶，位于染色體11p15.1-11p15.4，通過水解鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺、神經(jīng)鞘氨醇等活性脂類，調(diào)節(jié)膜結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。ASM/神經(jīng)酰胺信號通路具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的作用，在動脈粥樣硬化、心力衰竭等心血管疾病發(fā)病過程中扮演重要角色[14]。現(xiàn)有研究顯示ASM/神經(jīng)酰胺信號通路活化可抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，增加血管環(huán)超氧陰離子含量，進而導(dǎo)致動脈內(nèi)皮功能障礙[15]。ASM還可調(diào)節(jié)輔助性T淋巴細胞2（helper T lymphocyte 2，Th2）細胞因子釋放，ASM激活可引起Th2細胞分化，Th2細胞因子白細胞介素-5釋放，加重局部炎癥反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒血清ASM水平明顯高于對照組，IVIG反應(yīng)組血清ASM水平明顯低于IVIG無反應(yīng)組，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示ASM是KD患兒IVIG治療效果的影響因素之一，以上結(jié)果共同說明血清ASM水平升高與KD發(fā)病以及IVIG治療效果有關(guān)。分析原因為：KD脈管炎癥反應(yīng)可刺激ASM激活和易位，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺釋放，ASM/神經(jīng)酰胺信號通路激活后進一步調(diào)節(jié)細胞因子釋放，放大炎癥反應(yīng)，并促使細胞凋亡[17]，加速KD病情進展，導(dǎo)致IVIG治療無反應(yīng)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也顯示血清ASM水平與IL-2，CRP，IL-6，TNF-α均呈正相關(guān)，說明ASM可能通過誘導(dǎo)或加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致KD患兒對IVIG治療無反應(yīng)。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在心肌細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、淋巴細胞等不同類型細胞中廣泛表達，參與細胞增殖分化、突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，T細胞活化、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)和蛋白質(zhì)糖基化等病理生理過程[18-19]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)通路異常是KD易感的主要影響因素，游離胞質(zhì)Ca2+的濃度增加可導(dǎo)致 T 細胞中CaN過度活躍，繼而激活 T 細胞，導(dǎo)致單核細胞/巨噬細胞過度分泌白細胞介素-1β和TNF-α，誘導(dǎo)脈管炎癥反應(yīng)，該炎癥反應(yīng)進一步誘導(dǎo)尾加壓素-2信號傳導(dǎo)，加速血管內(nèi)皮細胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒血清CaN水平明顯升高，且CaN是IVIG治療效果的影響因素。分析可能的機制為：在應(yīng)激刺激下細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，T 細胞中CaN被激活，激活的CaN使活化T細胞核因子（nuclear factor of active T cells，NFAT）去磷酸化，調(diào)節(jié)NFAT靶基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)黏附分子和促炎細胞因子表達[21]，進而促使炎癥細胞浸潤，加劇血管炎性損傷，導(dǎo)致IVIG治療無反應(yīng)。另外，CaN亞基B與線粒體結(jié)合可增加細胞中Ca2+濃度和CaN活性，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和TNF-α表達，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[22]，影響IVIG治療效果。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也顯示CaN與KD患兒血清炎癥因子有關(guān)，說明CaN可能通過介導(dǎo)脈管炎癥反應(yīng)導(dǎo)致IVIG治療無反應(yīng)的發(fā)生。本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示CRP與IVIG治療無反應(yīng)存在密切關(guān)系，亦佐證了炎癥反應(yīng)與IVIG治療無反應(yīng)的關(guān)系。

綜上，KD患兒血清ASM，CaN水平均升高，且ASM，CaN與IVIG治療效果有關(guān)。ASM，CaN可能通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與IVIG治療無反應(yīng)的發(fā)生。臨床可通過檢測血清ASM，CaN水平變化，輔助判斷KD患兒IVIG治療反應(yīng)性，及時調(diào)整治療策略，改善患兒預(yù)后。本研究局限性在于未分析ASM，CaN與KD患兒冠狀動脈損傷之間的關(guān)系，望在以后研究中進行分析。