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    生色底物法測(cè)定肝素鈉的效價(jià)

    2022-10-15 01:46:14郝士婧張黎王琪
    上海醫(yī)藥 2022年19期
    關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀抗凝血酶肝素鈉

    郝士婧 張黎 王琪

    (上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240)

    肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物,主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療,其中,其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物[1-2]。

    中國藥典2020年版、美國藥典、歐洲藥典均收錄了生色底物法測(cè)定肝素鈉的效價(jià)[3-5],文獻(xiàn)所報(bào)道的內(nèi)容多側(cè)重于生色底物法與兔全血法進(jìn)行方法對(duì)比[6-7],抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子反應(yīng)特性[8-9],減少實(shí)驗(yàn)試劑用量的研究[10-12]等。本研究使用兩種不同的測(cè)試手段進(jìn)行生色底物實(shí)驗(yàn),考察兩種手段的實(shí)驗(yàn)特性,對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果,給實(shí)驗(yàn)室提供更加合適的實(shí)驗(yàn)方案。

    實(shí)驗(yàn)生色底物法利用生色底物在特定可見光下的吸光度來定量反應(yīng)程度,可見光和吸光度可以由紫外可見分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀兩種技術(shù)手段提供,由于方法采用了生物檢定量反應(yīng)的平行線法,考慮酶標(biāo)儀樣品池恒溫并且一次多量的讀數(shù)方式更為便捷,但得到的數(shù)據(jù)可信限率經(jīng)常在5%以上[6-7]。采用紫外可見分光光度計(jì)需配備另外的恒溫裝置,由于紫外可見分光光度計(jì)所需求的待測(cè)溶液量較大,操作方法更復(fù)雜,相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)成本也較高。實(shí)驗(yàn)室擬考察采用紫外可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀兩種方法,對(duì)比它們的便捷程度、實(shí)驗(yàn)成本、結(jié)果可靠信和可信限率。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)原理

    血液中Ⅱa因子和Ⅹa因子起到了凝血作用的90%以上,生色底物法就是測(cè)定肝素鈉抗Ⅱa因子活性和抗Ⅹa因子活性。肝素鈉激活抗凝血酶,被激活的抗凝血酶與加入的凝血酶反應(yīng),隨即在體系中加入過量的生色底物,底物與未發(fā)生反應(yīng)的抗凝血酶結(jié)合,而體系中剩余的生色底物在一定的波長(zhǎng)下有光吸收,可經(jīng)過測(cè)定定量,即可反推出體系中的抗凝血作用量[9-11]。原理示意圖見圖1。

    圖1 生色底物實(shí)驗(yàn)原理示意圖

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

    UV2550/UV2700型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);Spectra Max M2型酶標(biāo)儀(美國Molecular公司);中國藥典生物鑒定統(tǒng)計(jì)程序BS2000。

    發(fā)色底物S-2238和S-2765、抗凝血酶Ⅲ(10 IU)、Ⅹa因子(71 nkat)(Chromogenix公司);Ⅱa因子(580 IU,Hyphen BioMed公司);三羥基氨基甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司-沃凱);聚乙二醇6000(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);肝素鈉原料藥(東營(yíng)天東制藥有限公司提供);肝素鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1)紫外可見分光光度法(UV-VIS) 根據(jù)CHP2020,抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定:樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測(cè)液,抗凝血酶0.25 IU/mL,凝血酶5 IU/mL,底物0.625 mmol/L。使用紫外可見分光光度法,反應(yīng)在37 ℃恒溫水浴中進(jìn)行,順次加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品100 μL,抗凝血酶100 μL,凝血酶200 μL,底物 200 μL,反應(yīng)終止劑50%醋酸200 μL,每隔12 s順次加入反應(yīng)試劑。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,需平行測(cè)定兩次。

    2)酶標(biāo)儀法(ELIASA) 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測(cè)液,抗凝血酶0.25 IU/mL,凝血酶5 IU/mL,底物0.625 mmol/L。使用酶標(biāo)儀,反應(yīng)溫度37 ℃,利用酶標(biāo)儀自帶的加熱搖勻功能混勻。順次加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品25 μL,抗凝血酶25 μL,凝血酶 50 μL(16 IU/mL),底物 50 μL,反應(yīng)終止劑50%醋酸200 μL,反應(yīng)試劑的加入采用8通道移液槍差量加入法。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行測(cè)定兩次。

    3)抗Ⅹa因子效價(jià)測(cè)定 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.049 0、0.034 3、0.024 0、0.016 8 IU/mL的待測(cè)液,抗凝血酶1 IU/mL,Ⅹa因子0.4 IU/mL,底物1 mmol/L。反應(yīng)方法參考抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法[3]。

    檢測(cè)數(shù)據(jù)通過BS2000統(tǒng)計(jì)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸P值小于0.01,偏離平行P值大于0.05,二次曲線P值大于0.05,反向二次曲線P值大于0.05,且可信限率(FL)小于10%時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效。

    2 結(jié)果

    2.1 UV-VIS測(cè)定肝素鈉效價(jià)

    測(cè)定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價(jià)(表1)和Ⅹa因子效價(jià)(表2)。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線的P值均達(dá)到中國藥典2020年版四部通則1431生物檢定統(tǒng)計(jì)法可靠性測(cè)驗(yàn)的要求,而可信限率值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小。

    表1 UV-VIS測(cè)定抗Ⅱa因子效價(jià)

    表2 UV-VIS測(cè)定抗Ⅹa因子效價(jià)

    2.2 ELIASA測(cè)定肝素鈉效價(jià)

    同樣測(cè)定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價(jià)(表3)和Ⅹa因子效價(jià)(表4)。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線P值均達(dá)到要求,可信限率值小于10 %,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4 %。

    表3 ELIASA測(cè)定抗Ⅱa因子效價(jià)

    表4 ELIASA測(cè)定抗Ⅹa因子效價(jià)

    2.3 兩種方法結(jié)果對(duì)比

    兩種檢測(cè)方法所獲數(shù)據(jù)的對(duì)比表明,其所測(cè)效價(jià)較一致,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%左右。UV-VIS的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比ELIASA小2%左右,其實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好;UVVIS的可信限率較ELIASA小5%,故其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確可信。不過,ELIASA的檢測(cè)用時(shí)明顯小于UV-VIS(表5)。

    表5 兩方法測(cè)定肝素鈉效價(jià)的比較

    3 討論

    相較于文獻(xiàn)中使用更多的ELIASA測(cè)定法[6-10],UV-VIS的可信限率明顯更低,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確可信。UVVIS法需按待測(cè)順序每隔12 s順次加入反應(yīng)試劑,并進(jìn)行手動(dòng)混均,共計(jì)54次,對(duì)時(shí)間準(zhǔn)確性要求和實(shí)驗(yàn)人員操作要求較高。

    UV-VIS由于需要的待測(cè)溶液量較大,所以實(shí)驗(yàn)成本較高,但在使用了石英黑壁微量比色皿,并在樣品池中加墊片后可大大減少待測(cè)溶液用量,大幅降低實(shí)驗(yàn)成本,可彌補(bǔ)UV-VIS試劑成本較高的缺陷。

    無論采用UV-VIS還是ELIASA,生色底物法測(cè)定肝素鈉效價(jià)可獲得較精準(zhǔn)的測(cè)定數(shù)據(jù),所采用的儀器設(shè)備和試劑試液相較于生物測(cè)定兔全血法更易于操作控制,實(shí)驗(yàn)誤差可控。兩種方法均可獲得可靠有效的檢測(cè)數(shù)據(jù),有較好的實(shí)驗(yàn)室可行性。同時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)方法的不斷優(yōu)化提出了進(jìn)一步要求,即進(jìn)一步降低UV-VIS法操作難度,進(jìn)一步降低ELIASA測(cè)定法的可信限率等。

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