陸地棉WRKYⅠ亞家族成員的鑒定與表達(dá)分析

韓立軍，劉寶玲，李潤(rùn)植，薛金愛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是指與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白[1]。自ULMASOV等[1]從甘薯中鑒定出第1個(gè)WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子SPF1以來，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子相繼在水稻、小麥、番茄等多種植物中被發(fā)現(xiàn)[2-4]。WRKY因其蛋白含有高度保守的WRKYGQK七肽結(jié)構(gòu)而得名，每個(gè)家族成員具有1～2個(gè)七肽保守序列（N端）和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（C端）構(gòu)成。WRKY域由60個(gè)氨基酸組成，C端為鋅指結(jié)構(gòu)C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）[5]。N端的WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域能識(shí)別并結(jié)合保守的DNA結(jié)合位點(diǎn)W-Box（TTTGACC/T）進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[6]。盡管WRKYGQK高度保守，但在擬南芥、大豆、水稻等植物中發(fā)現(xiàn)WRKYGQK與鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生了變異[7-10]。根據(jù)七肽保守序列數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)將WRKY蛋白家族分成了三大類，第Ⅰ類和第Ⅱ類含有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，差別在于第Ⅰ類含有2個(gè)七肽保守序列而第Ⅱ類僅含有1個(gè)；第Ⅲ類則含有1個(gè)七肽保守序列和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)。其中，第Ⅰ類近N端七肽保守序列的DNA結(jié)合活性較弱，但近C端的七肽保守序列特異性增強(qiáng)與靶基因的結(jié)合[11-12]。WRKY作為植物最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理過程以及多種生物和非生物脅迫響應(yīng)等[13]。魏鑫等[14]通過構(gòu)建棉花GhWRKY33過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhWRKY33響應(yīng)干旱脅迫，過表達(dá)后能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性。蘇瑩等[15]研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY41過表達(dá)株系中，GhWRKY41參與了棉花響應(yīng)鹽和干旱脅迫應(yīng)答過程，且過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因棉花耐鹽性和耐旱性。嚴(yán)曉紅等[16]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)干旱脅迫下萌發(fā)棉籽的子葉和胚根中WRKY的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WRKY主要在胚根中表達(dá)從而響應(yīng)干旱脅迫。雷煜等[17]利用VIGS沉默技術(shù)抑制GhWRKY22基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默植株對(duì)大麗輪枝菌的敏感性增加，證明GhWRKY22基因正調(diào)控棉花的抗病性。劉秀芳[18]利用組織培養(yǎng)的方法將GhWRKY25異源轉(zhuǎn)化到本生煙中，結(jié)果獲得GhWRKY25超表達(dá)植株；與野生型本生煙相比，T3超表達(dá)GhWRKY25植株增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的敏感性，并參與了ROS代謝路徑。目前，關(guān)于陸地棉中GhWRKY的研究多集中在生物及非生物脅迫方面[19]，而對(duì)于WRKY參與種子萌發(fā)過程調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。盡管已有研究表明，擬南芥AtWRKYⅠ亞家族中的AtWRKY2與種子萌發(fā)有關(guān)[20]，但目前仍不清楚陸地棉WRKYⅠ亞家族成員是否也可能調(diào)控陸地棉種子萌發(fā)。

棉花作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量與品質(zhì)制約著與之相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，系統(tǒng)鑒定異源四倍體陸地棉的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族，將有助于深入解析棉花的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答等生命活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制。本研究聚焦全基因組鑒定陸地棉（Gossypium hirsutum）GhWRKYⅠ亞家族，應(yīng)用組學(xué)工具檢測(cè)GhWRKYⅠ家族基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)陸地棉GhWRKYⅠ亞家族基因的組織表達(dá)差異和對(duì)多種非生物脅迫的應(yīng)答進(jìn)行了分析，進(jìn)一步論證了參與棉籽萌發(fā)調(diào)控的候選GhWRKY24基因的表達(dá)譜，研究結(jié)果將為GhWRKYⅠ亞家族蛋白生物學(xué)功能和棉籽萌發(fā)調(diào)控機(jī)制的研究提供新的科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 陸地棉WRKYⅠ亞家族成員的鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

從TAIR里獲取擬南芥WRKYⅠ所有蛋白序列，利用這些序列在棉花數(shù)據(jù)庫(kù)CottonFGD（https://cottonfgd.org/）進(jìn)行BLASTP，獲得陸地棉WRKYⅠ所有蛋白序列，通過同源性比對(duì)去掉重復(fù)序列后，在CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term=）中查找具有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的所有序列，獲得GhWRKYⅠ亞家族所有成員。在CottonFGD中下載陸地棉基因組注釋文件，使用TBtools進(jìn)行染色體定位。

使 用LocTree3（https://rostlab.org/services/loctree3/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，并在SIB（http://expasy.org/）中獲得GhWRKYⅠ亞家族成員的氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、穩(wěn)定性和親水指數(shù)。利用Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2 陸地棉WRKYⅠ亞家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

從PlantFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）中獲得擬南芥、水稻W(wǎng)RKYⅠ亞家族蛋白序列（表1）。在MAGE 7.0軟件里采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）對(duì)擬南芥、水稻和陸地棉WRKYⅠ亞家族蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，抽樣次數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000次。

表1 擬南芥和水稻W(wǎng)RKYⅠ基因登錄號(hào)Tab.1 Gene accession numbers of WRKYⅠsubfamily genes in Arabidopsis and rice

1.3 陸地棉WRKYⅠ蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)的分析

利用TBtools與陸地棉基因組注釋文件獲得GhWRKYⅠ蛋白，在CDD中分析GhWRKYⅠ蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用在線網(wǎng)站MEME（http://memesuite.org/）預(yù)測(cè)陸地棉GhWRKYⅠ蛋白保守基序，保守基序數(shù)目為10；其他參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值。

1.4 GhWRKYⅠ亞家族蛋白同源性比對(duì)

利用GhWRKYⅠ亞家族蛋白序列在DNAMAN中進(jìn)行多重序列比對(duì)，分析亞家族組內(nèi)成員的WRKY保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 陸地棉WRKYⅠ亞家族基因的組織特異性及4種非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

在棉花庫(kù)CottonFGD（https://cottonfgd.org/）中下載陸地棉WRKY基因家族在不同組織及冷、熱、鹽、PEG等4種脅迫下的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用軟件TBtools繪制GhWRKYⅠ亞家族基因組織表達(dá)及脅迫表達(dá)熱圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 GhWRKY24在種子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)分析

將陸地棉（冀豐1271）在28℃、16 h光照/8 h黑暗條件下分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）檢測(cè)其表達(dá)量。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的GhWRKY24CDS序列，用Primer 6.0設(shè) 計(jì)qRT-PCR特異性引物（表2），并由上海生工公司合成引物。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為10 μL：TB Green為5 μL，ddH2O為3.4 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA為0.8 μL。反應(yīng)條件為：95℃5 s；59℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以Histone作為內(nèi)參基因，每樣品設(shè)3次重復(fù)，最終結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量（0 h為對(duì)照）。

表2 GhWRKY24基因的qRT-PCR引物Tab.2 Primers for qRT-PCR of GhWRKY24 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhWRKYⅠ基因家族成員的鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

通過篩選、整合，最終鑒定出35個(gè)具有2個(gè)七肽保守序列的GhWRKYⅠ亞家族基因，不均勻地分布在19條染色上（圖1），依次命名為GhWRKY1～GhWRKY35；其中，在A亞基因組的10條染色體上分布著19個(gè)GhWRKYⅠ基因，在D亞基因組的9條染色體上分布著16個(gè)GhWRKYⅠ基因，在D4染色體上分布的基因多達(dá)5個(gè)，A4、A5、A7、A13、D13均含有3個(gè)GhWRKYⅠ，A8和D8上分布有2個(gè)GhWRKYⅠ，其余11條染色體各分布有1個(gè)GhWRKYⅠ。這些基因的分布取決于從原始的二倍體陸地棉進(jìn)化到四倍體陸地棉過程中相應(yīng)基因發(fā)生串聯(lián)重復(fù)等因素。

圖1 GhWRKYⅠ家族基因在染色體上的分布Fig.1 Distribution of GhWRKYⅠsubfamily genes on chromosomes

由表3可知，GhWRKYⅠ家族基因編碼的氨基酸數(shù)目為331（GhWRKY9）～769個(gè)（GhWRKY33），分子質(zhì)量在36.50（GhWRKY9）～82.87 ku（GhWRKY33）。有15個(gè)GhWRKYⅠ蛋白的理論等電點(diǎn)小于7，呈酸性，其余20個(gè)GhWRKYⅠ蛋白的理論等電點(diǎn)大于7，呈堿性。所有GhWRKYⅠ蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。從親水指數(shù)來看，GhWRKYⅠ的所有成員都是親水性蛋白，均定位在細(xì)胞核中。

表3 GhWRKYⅠ基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)Tab.3 Physicochemical properties of GhWYKYⅠgene and its coding proteins

續(xù)表3 GhWRKYⅠ基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)Tab.3（Continued）Physicochemical properties of GhWYKYⅠgene and its coding proteins

2.2 GhWRKYⅠ亞家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過聚類分析（圖2），發(fā)現(xiàn)陸地棉、擬南芥和水稻這3個(gè)物種的WRKYⅠ亞家族成員盡管同屬一類，但還是存在著3種不同的進(jìn)化方向，表明這3個(gè)物種在分化形成之前已經(jīng)發(fā)生了基因擴(kuò)增事件，它們可能在植物不同生理過程中發(fā)揮著不同的作用。從整體看，與擬南芥的聚類相比，與水稻關(guān)系更近，這可能與物種本身在進(jìn)化過程中陸地棉的GhWRKYⅠ的選擇壓力有關(guān)。

圖2 擬南芥、陸地棉、水稻W(wǎng)RKYⅠ蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of WRKYⅠproteins from Arabidopsis，upland cotton and rice

2.3 陸地棉WRKYⅠ蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)的分析

如圖3所示，GhWRKYⅠ保守基序排序相似，數(shù)目為6～10個(gè)，其中Motif1～Motif5最為保守。根據(jù)陸地棉基因組注釋文件檢測(cè)到，GhWRKYⅠ亞家族的保守結(jié)構(gòu)域都包含N端和C端的2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域。從基因結(jié)構(gòu)看，GhWRKYⅠ亞家族具有3～6個(gè)外顯子和2～5個(gè)內(nèi)含子。

圖3 GhWRKYⅠ蛋白及基因結(jié)構(gòu)Fig.3 The structures of GhWRKYⅠgenes and their encoded proteins

GhWRKY3、GhWRKY6、GhWRKY7、GhWRKY11、GhWRKY12、GhWRKY15不 具 有5'-UTR，其 余29個(gè)GhWRKYⅠ亞家族基因同時(shí)含有5'-UTR和3'-UTR序列。

2.4 GhWRKYⅠ亞家族蛋白同源性比對(duì)

對(duì)GhWRKYⅠ亞家族蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），各成員N端WRKY結(jié)構(gòu)域高度保守，但GhWRKY11蛋白C端WRKY保守結(jié)構(gòu)域的WRKYGQK序列突變?yōu)閃RNYGQK。除此之外，還檢測(cè)到C端的C2H2（C-X4-C-X23-H-X-H）型鋅指結(jié)構(gòu)。

圖4 GhWRKYⅠ蛋白多重序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of GhWRKYⅠproteins

2.5 GhWRKYⅠ亞家族基因在不同組織及在冷、熱、鹽、PEG、CK脅迫下的表達(dá)模式分析

由圖5可知，GhWRKYⅠ亞家族的多數(shù)基因都表現(xiàn)出了組織特異性和對(duì)不同的非生物脅迫的響應(yīng)特征，例如GhWRKY2、GhWRKY4、GhWRKY8、GhWRKY21、GhWRKY22、GhWRKY24、GhWRKY31在各個(gè)組織與多種非生物脅迫下都有著較高的表達(dá)量。

圖5 GhWRKYⅠ亞家族基因在不同組織及脅迫下的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of GhWRKYⅠsubfamily genes in different tissues and various stresses

GhWRKY6、GhWRKY7、GhWRKY11、GhWRKY14、GhWRKY18、GhWRKY23和GhWRKY29在不同組織及脅迫下表達(dá)量極低。結(jié)合進(jìn)化樹的分布情況可以看出，這些低表達(dá)的GhWRKYⅠ基因所在的染色體上還存在著1個(gè)或多個(gè)其他GhWRKYⅠ亞家族基因，這些表達(dá)量極低的基因可能是陸地棉在進(jìn)化過程中的冗余基因。

GhWRKY2、GhWRKY3、GhWRKY21和Gh-WRKY25在莖中表現(xiàn)出極高的表達(dá)量，表明它們很可能參與莖的形態(tài)建成。與其他亞家族成員相 比，GhWRKY2、GhWRKY21、GhWRKY24和GhWRKY25更多地在種子中高表達(dá)，其中以GhWRKY24表達(dá)量最高，推測(cè)其與種子發(fā)育以及種子萌發(fā)有關(guān)。

2.6 GhWRKY24在種子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)模式分析

進(jìn)一步檢測(cè)了GhWRKY24在陸地棉種子萌發(fā)過程中的表達(dá)譜，qRT-PCR結(jié)果表明（圖6），在陸地棉種子萌發(fā)的5 h內(nèi)，GhWRKY24的表達(dá)量基本沒有升高，此時(shí)，棉籽正處于吸漲時(shí)期，并無(wú)強(qiáng)烈生化反應(yīng)；從10 h起，該基因表達(dá)量開始升高，24～48 h表達(dá)量急劇增加，在72 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。基因表達(dá)譜分析顯示，GhWRKY24可能是參與棉花種子萌發(fā)生理生化調(diào)控的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。

圖6 GhWRKY24在種子萌發(fā)過程的表達(dá)譜分析Fig.6 Expression analysis of GhWRKY24 during seed germination process

3 結(jié)論與討論

WRKY是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境響應(yīng)方面發(fā)揮著重要功能。目前，對(duì)于棉花WRKY的研究大多集中在逆境脅迫響應(yīng)和參與植物衰老進(jìn)程[21-22]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與棉籽萌發(fā)過程調(diào)控的研究卻鮮有報(bào)道[19]。與棉花其他WRKY亞家族研究相比[23]，有關(guān)陸地棉WRKYⅠ亞家族成員的鑒定，尤其是生物功能的研究有限。因此，鑒定異源四倍體陸地棉WRKYⅠ亞家族成員及其生物學(xué)功能可為全面解析棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和棉花遺傳改良提供新的科學(xué)參考。

采用組學(xué)工具，本研究從陸地棉基因組共鑒定出35個(gè)含有2個(gè)WRKY保守域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的GhWRKYⅠ亞家族基因。這些基因不均勻地分布于A亞基因組和D亞基因組的19條染色體上，均為定位于細(xì)胞核的親水性蛋白，基因內(nèi)含子和外顯子分別為2～5個(gè)和3～6個(gè)，其編碼331～769個(gè)氨基酸，其中15個(gè)WRKY蛋白為酸性蛋白，20個(gè)為堿性蛋白，這與其他植物轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位一致[24-25]。GhWRKYⅠ亞家族蛋白保守基序的排列順序相似，但含有的基序數(shù)目差異較大，最少的僅有6個(gè)，最多的有10個(gè)。盡管WRKY結(jié)構(gòu)域高度保守，但在擬南芥[7]、大豆[8]、水稻[9]等植物中發(fā)現(xiàn)了WRKYGQK肽鏈和鋅指結(jié)構(gòu)的變異。本研究中，GhWRKY11蛋 白C端WRKY保守結(jié)構(gòu) 域 的WRKYGQK序列突變?yōu)閃RNYGQK，而其他GhWRKYⅠ蛋白WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列未出現(xiàn)變異。與之不同的是棉花其他WRKY亞家族蛋白的WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列變異較多[26]。

WRKY蛋白聚類分析顯示，陸地棉、擬南芥、水稻的GhWRKYⅠ亞家族組內(nèi)成員之間存在著3種不同的進(jìn)化方向，表明這3個(gè)物種在分化形成之前已經(jīng)發(fā)生了基因擴(kuò)增事件?；蛑g的聚類分組，對(duì)于推測(cè)基因的生物學(xué)功能具有重要的參考價(jià)值。例如，AtWRKY11與AtWRKY17同為G2-d組，在擬南芥對(duì)丁香假單胞菌抗病性方面具有相似的功能[27]。與之相對(duì)應(yīng)的棉花GhWRKY成員也可能具有相似的功能，但這需要進(jìn)一步試驗(yàn)鑒定。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)陸地棉GhWRKYⅠ亞家族基因的組織與逆境表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)

GhWRKY6、GhWRKY7、GhWRKY11、GhWRKY14、GhWRKY18、GhWRKY23和GhWRKY29在不同組織及脅迫下未檢測(cè)到表達(dá)，推測(cè)這些基因可能為陸地棉進(jìn)化過程中產(chǎn)生的冗余基因，這也是生物有機(jī)體減少外界不利環(huán)境對(duì)其生存影響的一種保險(xiǎn)對(duì)策[28]。GhWRKY2、GhWRKY4、GhWRKY8、

GhWRKY21、GhWRKY22、GhWRKY24、GhWRKY31在所測(cè)各組織中高水平表達(dá)，預(yù)示著他們可能參與各個(gè)組織的生理生化反應(yīng)以及對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)，這些基因的多重生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制有待深入研究。WRKY參與多種植物信號(hào)分子的調(diào)控途徑，其中赤霉素和生長(zhǎng)素均能調(diào)控莖的 伸 長(zhǎng)[29]。本 研 究 中，GhWRKY2、GhWRKY3、GhWRKY21和GhWRKY25在莖中顯著表達(dá)，這4個(gè)棉花GhWRKYⅠ轉(zhuǎn)錄因子是否通過調(diào)控這2種激素來參與陸地棉莖的生長(zhǎng)還需要進(jìn)一步探究。

更重要的是，已有研究報(bào)道了一些棉花WRKY成員的功能。例如，轉(zhuǎn)基因擬南芥試驗(yàn)證明，棉花GhWRKY33負(fù)調(diào)控植物抗旱性[30]；棉花GhWRKY22參與花藥和花粉的發(fā)育調(diào)控[31]；GhWRKY27協(xié)同調(diào)控陸地棉衰老途徑[32]；異源過表達(dá)棉花GhWRKY53導(dǎo)致擬南芥植株腺毛密度顯著增加[33]。與這些有關(guān)棉花WRKY的研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY2、GhWRKY21、GhWRKY24和GhWRKY25在陸地棉種子中高度表達(dá)，特別是GhWRKY24在棉花種子萌發(fā)過程中表達(dá)量顯著上調(diào)，預(yù)示著GhWRKY24可能介導(dǎo)棉花種子萌發(fā)過程中生理生化的調(diào)控。擬南芥AtWRKY41敲除突變體顯著下調(diào)了ABI3并影響了種子休眠[34]。后續(xù)需要試驗(yàn)檢測(cè)GhWRKY24是否也能通過調(diào)控激素來參與種子萌發(fā)過程的調(diào)控。本研究結(jié)果為全面解析GhWRKYⅠ亞家族成員的生物學(xué)功能和棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)陸地棉種子萌發(fā)過程調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，亦為陸地棉遺傳改良提供了可挖掘的基因資源。