匹多莫德對紫癜性腎炎模型大鼠蛋白尿和腎組織的影響及其機(jī)制*

談晶晶， 沈理宇， 蔡夢旭

(江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院 腎內(nèi)科, 江蘇 常州 213300)

過敏性紫癜(henoch schonlein purpura，HSP)是小兒常見的系統(tǒng)性小血管炎癥性疾病，以侵犯皮膚并累及其他器官細(xì)小動(dòng)脈或毛細(xì)血管為主要特征[1]。紫癜性腎炎(henoch schonlein purpura nephritis，HSPN)是HSP主要的繼發(fā)性疾病，占總HSP發(fā)病例數(shù)的30%～50%[2-3]。HSPN臨床主要表現(xiàn)為皮疹、血尿、蛋白尿等，病理變化主要為腎小球系膜增生及IgA沉積[4]。多數(shù)HSPN預(yù)后較好，但仍有部分患兒腎臟受累嚴(yán)重，腎功能受損可能發(fā)展至終末期腎病，若不及時(shí)治療可能導(dǎo)致腎衰竭甚至危及生命[5]。目前臨床對HSPN尚缺乏理想西藥治療，主要以免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等進(jìn)行對癥治療，但效果并不理想。匹多莫德是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，臨床常用治療兒童呼吸道感染性疾病及過敏性疾病[6-7]，近年來研究顯示匹多莫德對固有免疫、適應(yīng)性免疫均具有調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)多種炎癥免疫相關(guān)疾病，可預(yù)防小兒HSP復(fù)發(fā)，改善HSPN患者的免疫功能[8-9]。關(guān)于匹多莫德對HSPN腎組織病理改變的影響及機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究探討。為此，本研究通過建立HSPN大鼠模型，探討匹多莫德對模型鼠尿蛋白及腎組織病理改變的影響及其機(jī)制，以期為小兒HSPN的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，40只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011]，實(shí)驗(yàn)前血尿及蛋白尿檢測均為陰性。

1.1.2藥物與主要試劑儀器 匹多莫德(江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司蘇州制藥廠，國藥準(zhǔn)字H20030462)、牛血清白蛋白(bovine Serum Albumin，BSA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司)、四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4，上海思言生物科技有新公司)、干姜(深圳市益生堂藥業(yè)有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國Thermo Fisher公司)、兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、Smad同源物4(Smad homolog 4，Smad4)、Smad同源物7(Smad homolog 7，Smad7)多抗(武漢博士德生物工程有限公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG單抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、41800型小動(dòng)物代謝籠(意大利Ugo Basile公司)、AU5800型全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)(美國BeckMan Coulter公司)、SM2010R徠卡切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、電泳儀(美國Bio-rad公司)；基因引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物模型建立[10]以4 mL/kg體質(zhì)量灌胃濃度為10%的免疫原BSA，隔天1次，連續(xù)8周；皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl 4 0.1 mL，每周1次，連續(xù)9周；于第6、8、10及12周尾靜脈注射濃度為0.025%的LPS 0.2 mL；于第9～12周，以10 mL/kg體質(zhì)量灌胃濃度為25%的干姜水，隔天1次；室溫下飼養(yǎng)。12周后，收集大鼠尿液，出現(xiàn)血尿、蛋白尿則建模成功。

1.2.2分組及給藥 選取40只大鼠，隨機(jī)選取10只作為對照組，于造模操作同時(shí)間點(diǎn)灌胃蒸餾水、靜脈或皮下注射生理鹽水，至造模結(jié)束，室溫下飼養(yǎng)。剩余30只大鼠進(jìn)行HSPN模型制備，建模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組和匹多莫德組(本次建模成功28只，每組14只)，匹多莫德組腹腔注射10 mg/kg的匹多莫德，模型組和對照組均腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.324 h尿蛋白含量檢測 于給藥第7、14及28 天，代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，采用全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑盒測定24 h尿蛋白含量。

1.2.4腎臟組織學(xué)觀察 末次給藥后2 h處死所有大鼠，取出右腎，置入40%中性甲醛中固定48 h，取出后經(jīng)酒精梯度脫水，石蠟包埋后制作厚度為4 μm的切片。切片常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，中性樹膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察；另取石蠟切片，脫蠟、水化后，加入10 g/L過碘酸氧化15 min，蒸餾水沖洗晾干，碘酸雪夫(periodic acid schiff，PAS)染色[11]室溫孵育15 min，亞硫酸溶液沖洗3次，自來水沖洗2 min，晾干后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，Image Pro-Plus軟件分析腎小球內(nèi)紫紅色陽性面積灰度值。

1.2.5腎臟組織中白細(xì)胞介素-4(IL-4)和IL-1β水平檢測 參考文獻(xiàn)[12]方法處死所有的大鼠后，剖腹取左腎部分組織，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水按照1 ∶9稀釋后勻漿，3 000 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測勻漿上清液中IL-4、IL-1β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本濃度。

1.2.6腎組織TGF-β1、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)檢測 處死所有的大鼠后，取出左腎部分組織，液氮研磨后加入細(xì)胞裂解液，于冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，置于沸水水浴10 min變性，進(jìn)行蛋白總量測定。取待測蛋白進(jìn)行恒定電流的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠電轉(zhuǎn)致硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，加入1 ∶400稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入1 ∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，TGF-β1、Smad4、Smad7蛋白相對表達(dá)量以其灰度值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 匹多莫德對HSPN大鼠24 h尿蛋白的影響

隨給藥時(shí)間的延長，模型組24 h尿蛋白含量升高(P<0.05)；與對照組比較，模型組和匹多莫德組給藥第7、14及28 天時(shí)的24 h尿蛋白含量均升高，匹多莫德組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但匹多莫德組給藥第14 天與給藥第28 天時(shí)的24 h尿蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 匹多莫德對HSPN大鼠24 h尿蛋白的影響Tab.1 Effect of pidotimod on 24 h proteinuria levels in rats with

2.2 匹多莫德對HSPN大鼠腎臟組織學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無異常，腎小球系膜及基底膜無增生；模型組腎小管明顯腫脹伴有蛋白管型，腎小球系膜及基底膜增生，伴有腎小球囊腔閉塞，腎小球血管閉塞且伴大量炎性細(xì)胞浸潤；匹多莫德組干預(yù)后，腎小球系膜及基底膜增生、腎組織病理改變均較模型組減輕，但仍伴少量炎性細(xì)胞浸潤。PAS染色結(jié)果顯示，對照組、模型組及匹多莫德組陽性面積灰度值分別為(0.09±0.03)、(0.35±0.04)、(0.17±0.03)，對照組陽性面積灰度值低于模型組和匹多莫德組(t=19.457、7.055，匹多莫德組低于模型組(t=13.470)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和圖2。

圖2 HSPN大鼠腎小球PAS染色結(jié)果(PAS，×400)Fig.2 PAS staining of glomeruli in rats with HSPN (PAS,×400)

2.3 匹多莫德對HSPN大鼠腎臟組織炎性因子表達(dá)水平的影響

與對照組比較，模型組和匹多莫德組腎組織中IL-4、IL-1β水平均升高，其中匹多莫德組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組腎組織勻漿中IL-4、IL-1β水平比較Tab.2 Comparison of IL-4 and IL-1β levels in renal tissue homogenates among three

2.4 匹多莫德對HSPN大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組比較，模型組和匹多莫德組TGF-β1、Smad4蛋白相對表達(dá)水平升高，且匹多莫德組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，模型組和匹多莫德組Smad7蛋白相對表達(dá)水平降低，且匹多莫德組高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

HSPN是過敏性紫癜所致的繼發(fā)性腎小球腎炎，屬于兒科常見腎損傷性疾病，目前臨床多采用激素類或免疫機(jī)制劑進(jìn)行對癥治療HSPN[13]，但臨床研究顯示，激素類藥物對腎組織病變無效,，免疫抑制劑可改善腎臟受累現(xiàn)象但長期或大量用藥毒副作用大，對兒童生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響[14-15]。因此，亟需尋找安全有效藥物抑制HSPN蛋白尿及腎組織病理改變。匹多莫德是一種人工合成的高純度二肽小分子，具有較強(qiáng)的免疫活性，作用于免疫反應(yīng)的不同階段，具有增強(qiáng)炎性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體固有免疫能力等作用[16]。HSPN屬于小血管炎癥性疾病，腎小球系膜及基底膜增生等為主要病理改變，引起血尿和蛋白尿。在HSPN治療中，通過抑制血管內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而減輕腎組織病理變化，對延緩疾病進(jìn)程至關(guān)重要[17]。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖3 各組腎組織TGF-β1、Smad4、Smad7蛋白相對表達(dá)水平Fig.3 Comparison of the relative expression levels of TGF-β1, Smad4, and Smad7 proteins in renal tissues among three groups

本研究中，匹多莫德組給藥第7、14及28天時(shí)的24 h尿蛋白含量及PAS染色陽性面積灰度值均低于模型組，HE染色顯示，模型組腎小管明顯腫脹伴有蛋白管型，腎小球系膜及基底膜增生，伴有腎小球囊腔閉塞，腎小球血管閉塞且伴大量炎性細(xì)胞浸潤，提示匹多莫德可有效抑制HSPN大鼠蛋白尿，減輕腎組織病理損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腎組織中IL-4、IL-1β水平高于對照組，說明HSPN大鼠存在炎癥反應(yīng)激活現(xiàn)象；給予匹多莫德持續(xù)干預(yù)28 d后，大鼠腎臟組織中IL-4、IL-1β水平低于模型組，提示匹多莫德可抑制HSPN大鼠腎組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。有研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)在HSPN疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，HSPN患者常伴隨血清IL-4、IL-1β等炎癥因子水平的異常升高，與疾病轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[18-19]。匹多莫德自引入國內(nèi)以來，臨床應(yīng)用多集中于小兒急性呼吸系統(tǒng)疾病的治療中，效果顯著，且可有效調(diào)節(jié)患兒免疫功能[20]。孫福棟等[21]應(yīng)用匹多莫德配合常規(guī)西醫(yī)治療HSPN患兒結(jié)果顯示，匹多莫德臨床療效確切，有助于改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能，T淋巴細(xì)胞亞群平衡得到改善。本研究未對HSPN大鼠免疫功能研究，但機(jī)體中免疫與炎癥關(guān)系密切，IL-4、IL-1β細(xì)胞因子由T淋巴細(xì)胞分泌，匹多莫德干預(yù)后大鼠腎組織中IL-4、IL-1β細(xì)胞因子降低，說明匹多莫德可改善HSPN炎癥反應(yīng)，在進(jìn)一步研究中應(yīng)增加對HSPN免疫功能的觀察。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組腎組織中TGF-β1、Smad4蛋白相對表達(dá)量高于對照組，Smad7蛋白相對表達(dá)量低于對照組，說明HSPN大鼠存在腎組織纖維化增生現(xiàn)象；匹多莫德干預(yù)后，腎組織中TGF-β1、Smad4蛋白相對表達(dá)量低于模型組，Smad7蛋白相對表達(dá)量高于模型組，提示匹多莫德對HSPN大鼠蛋白尿抑制作用及對腎組織病理損傷減輕作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。腎纖維化是多種腎臟疾病進(jìn)展至終末期的病理基礎(chǔ)，TGF-β1/Smad信號(hào)通路在腎纖維化過程中起重要調(diào)控作用[22]。研究顯示，TGF-β1可通過自分泌或旁分泌途徑誘導(dǎo)腎間質(zhì)細(xì)胞病變，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積[23]。Smads蛋白是TGF-β1細(xì)胞內(nèi)底物，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，Smad4和Smad7是Smads家族重要成員，Smad4可以與活化的Smad2/3結(jié)合形成異多聚體，參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄；Smad7可以與活化I型受體結(jié)合，進(jìn)而抑制Smad2/3的磷酸化激活，負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)通路[24]。TGF-β1與Smad4結(jié)合提示纖維化通路被激活，而與Smad7結(jié)合提示纖維化信號(hào)通路被抑制，因此Smad4和Smad7在TGF-β1信號(hào)通路調(diào)控中有重要作用。周祖蓮等[25]研究發(fā)現(xiàn)，匹多莫德可有效抑制免疫球蛋白A腎病大鼠腎組織中的炎癥因子IL-4、IL-1β的表達(dá)，減少尿蛋白，改善腎纖維化病變，推測匹多莫德可通過抑制腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)減緩腎組織纖維化病理變化過程，與本研究結(jié)果相似。鑒于匹多莫德對機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，本研究通過建立HSPN大鼠模型，發(fā)現(xiàn)匹多莫德可通過抑制促炎因子IL-4、IL-1β表達(dá)，降低腎組織中纖維化相關(guān)因子TGF-β1、Smad4表達(dá)，促進(jìn)纖維化抑制因子Smad7表達(dá)，從而緩解腎臟炎癥病理改變，為HSPN臨床防治提供理論基礎(chǔ)。目前，臨床尚缺乏足夠多的證據(jù)支持匹多莫德有助于改善腎臟炎癥及纖維化病變，在接下來的研究中應(yīng)深入進(jìn)行研究，以期獲得更多的證據(jù)支持本研究結(jié)論，為匹多莫德的臨床用藥提供參考依據(jù)。

綜上所述，匹多莫德可有效抑制HSPN大鼠蛋白尿，減輕腎組織病理損傷，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)，為臨床HSPN的防治提供理論參考。在進(jìn)一步研究中應(yīng)繼續(xù)探尋匹多莫德有無通過其他信號(hào)通路作用于HSPN，為本研結(jié)論提供更充足的支持。