基于傳統(tǒng)煎藥工藝的錦燈籠飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量研究

邢海燕，李曉亮，張潔，李成網(wǎng)

（1.合肥市第二人民醫(yī)院（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥醫(yī)院），安徽 合肥 230012；2.安徽九方制藥有限公司，安徽 亳州 236800；3.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061）

錦燈籠是茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或者帶果實(shí)的宿萼?？啵?，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、化痰利咽、利尿通淋的功效［1］。錦燈籠主要含有甾體類、甾醇類、生物堿類、氨基酸類及其他類型化合物［2-4］。研究表明錦燈籠具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、利尿、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等藥理活性，作為一種清熱、解毒藥被廣泛應(yīng)用于臨床［5-8］。

中藥配方顆粒既符合中醫(yī)辨證論治，又具有免煎煮、起效快、攜帶方便、安全衛(wèi)生等特點(diǎn)而被臨床越來越廣泛使用［7-9］。同時(shí)也存在著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不高，臨床有效性和合理性尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證等問題［9-11］。國家藥品監(jiān)督管理局于2021年發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》，明確提出了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的概念。標(biāo)準(zhǔn)湯劑［12］是指以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論作為指導(dǎo)，選取主產(chǎn)區(qū)藥材或道地藥材，經(jīng)加工炮制而成合格飲片后，按照臨床應(yīng)用時(shí)傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法，參照現(xiàn)代中藥提取方法制備而成的單味中藥飲片水煎劑。將“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”作為中藥配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)參照物，來衡量與臨床湯劑是否基本一致，目前尚未有錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

以市售5個(gè)主產(chǎn)地15批錦燈籠飲片為材料，遵循標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法，用標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并以木犀草苷為指標(biāo)成分，考察其在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率、出膏率，并建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，為建立錦燈籠飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀（Thermo公司），配 置LPG-3400A四 元 泵、DAD檢 測(cè) 器、WPS-3000TSL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000SD柱溫箱；QUINTIX125D型電子天平（德國SARTORIUS公司），ATX124電子分析天平（SHIMADZU公司）；LC-12N-100B真空冷凍干燥機(jī)（南京鑫之曼葉設(shè)備有限公司）；RE5002型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（江蘇省常州恩培儀器有限公司）；KM-615B超聲清洗機(jī)（江蘇省常州市科盟儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

木犀草苷（批號(hào)：111720-201810；純度：93.5%）、木犀草素（批號(hào)：111520-201605；純度：99.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；酸漿苦味素A（批號(hào)：180301-025；純度：98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇色譜純（MERCK化學(xué)試劑公司）、其他試劑均為分析純，水為超純水。15批5個(gè)不同產(chǎn)地錦燈籠藥材均由亳州廣源堂中藥飲片有限公司提供。藥材詳細(xì)信息見表1。

表1 藥材來源信息Table 1 The sources information sheet of Physalis Calyxseuf Ructus

2 方法與結(jié)果

2.1 錦燈籠飲片的檢測(cè)

按照2020年版《中國藥典》“錦燈籠”飲片項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)［1］，15批錦燈籠飲片的性狀、鑒別及含量等均符合藥典規(guī)定，其中含水量為6.1%～7.8%、木犀草苷含量為0.12%～0.35%。

2.2 基源鑒定

經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)系劉守金教授鑒別，15批錦燈籠基源均為茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的 干 燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼，基源符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備[11]

稱取各批次錦燈籠飲片100 g，分別加12倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火保持微沸30 min，200目篩網(wǎng)過濾；藥渣再加10倍量水煎煮25 min，合并2次濾液，經(jīng)50℃減壓濃縮至150 mL的流浸膏，于冰柜冷凍（-40℃）后，再放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，測(cè)定其水分、出膏率。水分按照《中國藥典》2020年版四部通則0832項(xiàng)下第二法測(cè)定，計(jì)算：出膏率=［標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉/飲片質(zhì)量］×100%，結(jié)果見表2。

表2 錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉水分、出膏率的考察Table 2 The moisture，extractum rate of freeze-dried powder Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.4 錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑中木犀草苷含量研究

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加甲醇配制成含木犀草苷20 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備精密稱取各批次錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷后再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.4.3 色譜條件色譜柱：phenosphere luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長：350 nm；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 含量測(cè)定試驗(yàn)中的高效液相色譜圖Figure1 HPLC chromatograms in content determination test

2.4.4 線性關(guān)系考察精密稱取適量木犀草苷對(duì)照品，加70%甲醇分別制成每1 mL約含6、12、24、48、96 μg的對(duì)照品溶液，吸取上述溶液各20 μL，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以木犀草苷濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），350 nm波長下峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.951X+1.0267，R2=0.999 9。

2.4.5 精密度考察取錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號(hào)：2006001Y），按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定木犀草苷峰面積的RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察取錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算木犀草苷峰面積的RSD為0.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察取同一批錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，平行制備6份錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算供試品溶液中木犀草苷含量RSD為0.13%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率考察精密稱取已知含量錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑6份，分別精密加入等量木犀草苷對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算木犀草苷的加樣回收率為103.7%，RSD值為2.0%。

2.4.9 樣品測(cè)定按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定15批錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片中木犀草苷含量，按照W×X/M×100%計(jì)算木犀草苷的轉(zhuǎn)移率，其中，W為標(biāo)準(zhǔn)湯劑中木犀草苷的含量，X為飲片出膏率，M為飲片中木犀草苷的含量。見表3。

表3 錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑和藥材木犀草苷含量及轉(zhuǎn)移率Table 3 The luteoloside content and transfer rate of Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 色譜條件phenosipherelunaC18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）、0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件詳見表4，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：220 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL；色譜圖見圖2。

圖2 指紋圖譜試驗(yàn)中的對(duì)照品、供試品溶液色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms in fingerprint spectrum test

表4 梯度洗脫條件Table 4 Gradient elution program

經(jīng)查閱文獻(xiàn)并與對(duì)照品色譜圖比對(duì)后，指認(rèn)出2、4、6號(hào)峰分別為木犀草苷、木犀草素、酸漿苦味素A。木犀草苷為含量測(cè)定指標(biāo)成分，且其含量高、穩(wěn)定，故選擇2號(hào)峰為參照峰（S），以此計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要特征峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備精密稱取木犀草苷、木犀草素及酸漿苦味素A對(duì)照品適量，加70%甲醇配制成濃度分別為50、70、50 μg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備精密稱取各批次錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉末約0.2 g，分別置25 mL容量瓶中，加70%甲醇超聲溶解60 min，放冷后定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.5.4 精密度試驗(yàn)取錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號(hào)：2006001Y），按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以木犀草苷峰為參照（S峰），計(jì)算10個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值，結(jié)果均小于2%（n=6），表明本法精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號(hào)：2006001Y），分別于0、3、6、9、12、15、24 h注入液相色譜儀，記錄10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD值分別為0.02%～0.10%和0.41%～1.71%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn)取錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑（批號(hào)：2006001Y）粉末，研細(xì)，按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，記錄10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.04%～0.08%和1.21%～1.98%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 指紋圖譜的建立取15批錦燈籠飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉各適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定，采用國家藥典委員會(huì)公布發(fā)行的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）軟件”，對(duì)色譜圖進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，得到指紋圖譜（圖3）；該軟件通過均值法和中位數(shù)法，合成具有代表性的指紋圖譜作為對(duì)照?qǐng)D譜，采用夾角余弦法計(jì)算樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間的夾角余弦相似度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，相似度在0.9～1.0之間視為符合要求，結(jié)果見表5。確定了10個(gè)共有峰，15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度均大于0.9，表明各批錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有良好的特征性及穩(wěn)定性，符合指紋圖譜相似度要求。

表5 15批錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Similarity evaluation of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

圖3 15批錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜Figure 3 HPLC fingerprint spectrum of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

3 討論

本研究依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》及《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，基于傳統(tǒng)煎藥工藝，利用現(xiàn)代生產(chǎn)提取設(shè)備制備錦燈籠飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。按照《中國藥典》2020年版的方法，選取木犀草苷為錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分。15批不同產(chǎn)地的飲片中木犀草苷含量存在一定差異（范圍：0.13%～0.35%），含量波動(dòng)范圍較寬泛，真實(shí)反映出錦燈籠飲片市場(chǎng)的情況。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍在16.0%～24.1%之間，平均出膏率為21.2%，RSD為1.91%，表明本實(shí)驗(yàn)的制備工藝成熟、穩(wěn)定可靠。

木犀草苷為錦燈籠的主要有效成分，可溶于熱水、熱甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，微溶于水；參照2020年版《中國藥典》“錦燈籠”項(xiàng)下方法［1］，采用HPLC測(cè)定錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑中木犀草苷的含量來進(jìn)行質(zhì)量控制，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明：該方法針對(duì)性強(qiáng)、效果良好；在標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的過程中，錦燈籠中木犀草苷的平均轉(zhuǎn)移率為42.8%，轉(zhuǎn)移率范圍約為±10.0%［12-13］。

錦燈籠中除含有木犀草苷成分外，還含有有機(jī)酸類等其他成分，如僅以木犀草苷作為本品質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，就不能完整地反映錦燈籠化學(xué)組分特征。指紋圖譜能夠全面地體現(xiàn)中藥質(zhì)量，是目前控制中藥質(zhì)量的公認(rèn)評(píng)價(jià)模式［14-17］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，建立了錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性良好。指紋圖譜的建立克服了單一成分木犀草苷信息量不足的缺陷，可更加全面控制錦燈籠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量。本研究為錦燈籠配方顆粒的生產(chǎn)、質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)，提供了切實(shí)可行的試驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。