大理地區(qū)某規(guī)?；榕鲋聽倥８篂a的病原分析

周玉照 張小苗＊ 楊曉偉 張以芳

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 云南 大理 671003；2.鶴慶縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)莊園有限公司 云南 鶴慶 671500；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 昆明 650201）

隨著生活水平不斷提高，人們對乳制品和肉制品的需求量越來越大，牛群的健康就變得尤其重要，但目前犢牛腹瀉發(fā)病率高達90%，患牛病死率高達50%以上，腹瀉對犢牛的生長發(fā)育以及成活等都有很大影響[1]。因此，探究導(dǎo)致犢牛嚴(yán)重腹瀉的病因，對于臨床上防治該病具有重要的指導(dǎo)意義。大量研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒素性大腸桿菌、沙門氏菌、輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、隱孢子蟲以及球蟲等感染均可引起犢牛腹瀉，而且臨床上常呈現(xiàn)兩種以上病原混合感染[2]。腸致病性大腸桿菌引起的初生犢牛腹瀉及敗血癥，其發(fā)病率和病死率最高，是造成初生犢牛死亡的主要原因，占影響犢牛健康的首位。牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV）、牛輪狀病毒（BRV）是引起犢牛傳染性腹瀉的主要病毒，犢牛感染后導(dǎo)致免疫功能下降，引起嚴(yán)重腹瀉、脫水造成大批死亡，其中又以感染牛病毒性腹瀉病毒的發(fā)病率最高，危害最大[3]。根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的差異，BVDV又可分為I和II兩種基因型，不同基因型又可進一步分為不同基因亞型[4]。分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)目前流行的BVDV毒株主要以BVDV-1b和BVDV-1m兩種基因亞型為主[5]。本試驗對從大理地區(qū)某乳牛場采集的樣品進行細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、動物致病性試驗、菌毛基因和毒力基因檢測、藥敏試驗、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測及核苷酸序列分析，以期為大理地區(qū)某乳牛場找出引起該次犢牛腹瀉的病因，為該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2020年12月，從大理地區(qū)某乳牛場分別采集成年牛直腸棉拭子28份、腹瀉犢牛直腸棉拭子26份、氧化塘糞樣2份、分離后糞樣2份、墊料2份、全血11份，共71份樣品。

1.2 材料 普通肉湯、伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂、HE瓊脂、革蘭氏染色液、生化鑒定管、藥敏片、細菌DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Magen RNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α、pMDl9-T載體、DNA Marker DL 2000均購自寶生物工程(大連)有限公司；小白鼠由本實驗室飼養(yǎng)。

1.3 細菌分離培養(yǎng) 分別將犢牛和成年牛直腸棉拭子、氧化塘糞樣、分離后糞樣、墊料接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，革蘭氏染色鏡檢。將鏡檢有G-桿菌的培養(yǎng)液分別劃線于伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂、HE瓊脂，37℃培養(yǎng)18 h后，挑可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢后，選擇優(yōu)勢菌落接種于普通肉湯純培養(yǎng)，并命名為菌液1～菌液6。

1.4 生化試驗 取純培養(yǎng)普通肉湯菌液分別加入到生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～72 h后觀察并記錄結(jié)果。

1.5 動物致病性試驗 取21只健康小白鼠，隨機分成7組，每組3只，1～6試驗組小鼠分別腹腔注射犢牛A和B直腸棉拭子、成年牛A和B直腸棉拭子、分離后糞樣、墊料的純培養(yǎng)菌液各1 mL，空白對照組注射1 mL生理鹽水。接種后觀察小白鼠發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d，并對發(fā)病和死亡的小白鼠進行細菌分離鑒定。

1.6 菌毛基因和毒力基因檢測 應(yīng)用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計致病性大腸桿菌（K99）C83912菌毛基因、EAST1和ETT2毒力基因3對引物。引物序列為C83912-F：5'-CGCGGATCCAATACAGGTACTATTAA-3'，C83912-R：5'-CCGCTCGAGTTACATATAAGTGACT-3'；EAST1-F：5'-ATGCCATCAACACAGTATATC-3'，EAST1-R：5'-TCAGGTCGCGAGTGACGG-3'；ETT2-F：5'-TACTAATGCCATATAGCCCCATAA-3'，ETT2-R：5'-CTACGCTTTTAACAAACGATTGAT-3'。引物由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。

按照細菌DNA提取試劑盒操作說明，對分離純培養(yǎng)的菌液提取DNA，利用PCR分別擴增C83912菌毛基因、EAST1和ETT2毒力基因片段，PCR反應(yīng)體系（30 μL）：Ex Taq 0.5 μL，10×Ex Taq Buffer 3 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，dNTP 2.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸8 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 藥敏試驗 使用濃度梯度稀釋活菌計數(shù)法，統(tǒng)計純培養(yǎng)菌液含菌數(shù)為1.5×108個/mL。取菌液均勻涂布于瓊脂平板上，用鑷子將藥敏紙片平放在平板上，并輕壓使其緊貼平板表面，每個平板貼6張藥敏紙片，兩紙片相距23 mm，紙片與平板邊緣不小于15 mm，貼好紙片的平板于37℃培養(yǎng)24～72 h后，觀察并測量抑菌圈直徑，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判定結(jié)果[6]。

1.8 牛輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒PCR檢測 應(yīng)用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒3對引物。引物 序 列 為BRV VP6-F：5'-ATGGATGTCCTGTATTCCTT-3'，BRV VP-R：5'-ATGTATGTATGGACGAAATG-3'；BCV-F：5'-ATACCCCGGCTGACATTCTCG-3'，BCV-R：5'- CTCTTCTGGCGGGGCTTATTCA-3'；BVDV-F：5'-ATGGACACGAAAGAAGAA-3'，BVDV-R：5'-ATTATTTCAAGTCACAA-3'。按照RNA提取試劑盒操作說明，提取RNA，利用PCR分別擴增目的片段。

1.9 牛病毒性腹瀉病毒核苷酸序列分析 將PCR產(chǎn)物純化后送生工生物（上海）工程股份有限公司進行測序。利用BLAST將測序獲得的BVDV核苷酸序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的典型菌株進行同源性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 將鏡檢疑似為大腸桿菌的純培養(yǎng)菌液分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈粉紅色（見圖1 A-1），在HE培養(yǎng)基中菌落呈黃色（見圖1 A-2），在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈黑色帶金屬光澤（見圖1 A-3），初步確定為大腸桿菌。 統(tǒng)計后顯示在犢牛直腸棉拭子、分離后糞樣、墊料中大腸桿菌檢出率均為100%，而成年牛直腸棉拭子大腸桿菌檢出率為92.86%，氧化塘糞樣大腸桿菌檢出率為0%，大腸桿菌總檢出率為93.33%（見表1）。

圖1 細菌鑒別培養(yǎng)結(jié)果

表1 不同樣品大腸桿菌檢出結(jié)果

2.2 生化試驗結(jié)果 取純培養(yǎng)菌液分別加入到葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、木糖、麥芽糖、尿素、乳糖、甘露醇、鼠李糖、水楊素、七葉苷、肌醇等生化鑒定管中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h后，結(jié)果表明分離到的病原為致病性大腸桿菌（見表2）。

表2 生化試驗結(jié)果

2.3 動物致病性試驗結(jié)果 由表3可知，3組和4組的小白鼠全存活，說明在成年牛直腸棉拭子純培養(yǎng)菌液無致病性，而在犢牛直腸棉拭子、分離后糞樣、墊料中分離到的純培養(yǎng)菌液都具有很強的致病性。將死亡的小白鼠肝臟進行細菌分離培養(yǎng)，結(jié)果為致病性大腸桿菌。

表3 動物致病性試驗結(jié)果

2.4 菌毛基因和毒力基因檢測結(jié)果 用引物分別對1、2、5、6組菌液提取的DNA進行K99 C83912菌毛基因、EAST1和ETT2毒力基因片段PCR擴增。結(jié)果均獲得大小約445 bp的ETT2毒力基因和498 bp的C83912菌毛基因目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖2）。說明分離到的病原菌為致病性大腸桿菌K99。

圖2 ETT2毒力基因和C83912菌毛基因PCR擴增結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果 純培養(yǎng)菌液對10種藥物的藥敏試驗結(jié)果顯示，在犢牛直腸分離到的致病性大腸桿菌對青霉素耐藥，對阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢曲松、卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考藥物都敏感；在分離后糞樣和墊料分離到的致病性大腸桿菌對10種藥物都敏感。

2.6 牛輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒PCR檢測結(jié)果 用引物分別對BRV VP6基因、BCV和BVDV目的片段進行PCR擴增。結(jié)果在成年牛血樣中獲得大小約298 bp的BVDV目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖3），而犢牛血樣均為陰性。說明該乳牛場存在牛病毒性腹瀉病毒感染。

圖3 BVDV PCR擴增結(jié)果

2.7 牛病毒性腹瀉病毒核苷酸序列分析與遺傳進化分析結(jié)果 將上述PCR產(chǎn)物進行純化后測序，將其命名為DL BVDV。利用MegAlign軟件將測序獲得的序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3序列進行同源性比對分析。結(jié)果顯示獲得的DL BVDV序列與16個BVDV-1毒株序 列 同 源 性 為69.7%～99.1%，與BVDV-1b MR10899毒株序列同源性為99.1%，與BVDV-2 LN01毒株序列同源性為76.6%，與BVDV-3 Italy-10-1毒株序列同源性為74.7%（見圖4）。DL BVDV的遺傳進化與BVDV-1 FBS-C1、BVDV-1 TR85、BVDV-1b MR10899屬于同一分支，親緣關(guān)系近，而與其它不在同分支，親緣關(guān)系遠（見圖5）。說明獲得的DL BVDV屬于BVDV-1b亞型。

圖4 DL BVDV序列同源性比對分析

圖5 DL BVDV序列遺傳進化分析

3 討 論

表4 致病性大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

犢牛腹瀉是由細菌（大腸桿菌K99、沙門氏菌）、病毒（BVDV、BRV、BCV）等病原及營養(yǎng)、環(huán)境、飼養(yǎng)管理等諸多因素引起的一種疾病的總稱。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和BVDV是導(dǎo)致犢牛劇烈腹瀉甚至死亡的主要病原，而且康復(fù)后犢牛的生產(chǎn)性能也常常受到影響，已經(jīng)成為影響乳牛業(yè)健康發(fā)展的主要難題[7]。報道顯示，我國分離鑒定的BVDV毒株以BVDV1型為主，BVDV2型毒株流行區(qū)域較少，但近些年來，出現(xiàn)了越來越多關(guān)于我國牛群或豬群感染BVDV2型的報道[8]。目前BVDV-1已有22個基因亞型(1a-1v)，其中亞洲主要流行1m、1n、1o、1p、1q、1u和1v等7個亞型，而國內(nèi)主要流行1b和1m亞型[9]。自20世紀(jì)80年代以來，我國四川、甘肅、寧夏、新疆、青海、內(nèi)蒙古、山東、河南等20多個省市在牛、牦牛、綿羊、鹿等動物中均有感染該病毒的報道[10]。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，歐美等養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達國家均有檢出，牛群中抗體陽性率達50%～89%。美國主要流行的是BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2a，歐洲許多國家主要流行BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-1d、BVDV-1e和BVDV-1f，日本和韓國主要流行BVDV-1b，澳大利亞則主要流行BVDV-1c[11]。

本試驗對從大理地區(qū)某乳牛場采集的11份全血進行BVDV、BRV、BCV檢測，結(jié)果BRV和BCV均為陰性，而成年牛BVDV為陽性，犢牛BVDV為陰性；陽性樣品經(jīng)測序分析，結(jié)果與16個BVDV-1毒株序列同源性為69.7%～99.1%，與BVDV-1b MR10899毒株序列同源性為99.1%，與BVDV-2 LN01毒株序列同源性為76.6%，與BVDV-3 Italy-10-1毒株序列同源性為74.7%；且遺傳進化與BVDV-1 FBS-C1、BVDV-1 TR85、BVDV-1b MR10899屬于同一分支，親緣關(guān)系近，而與其它不在同分支，親緣關(guān)系遠，屬于BVDV-1b亞型。說明大理地區(qū)存在牛BVDV感染。同時，考慮到細菌感染也會引起犢牛腹瀉，試驗還對采集的60份樣品（成年牛直腸棉拭子、腹瀉犢牛直腸棉拭子、氧化塘糞樣、分離后糞樣、墊料）進行細菌分離、生化試驗、動物致病性試驗、菌毛基因和毒力基因檢測、藥敏試驗，結(jié)果在腹瀉犢牛直腸棉拭子、分離后糞樣、墊料中分離到4個致病力很強的大腸桿菌，且都攜帶ETT2毒力基因和C83912（K99）菌毛基因；在犢牛直腸分離到的致病性大腸桿菌對青霉素耐藥，對阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢曲松、卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考藥物都敏感；在分離后糞樣和墊料中分離到的致病性大腸桿菌對10種藥物都敏感。

目前對于大腸桿菌病的治療還是以抗生素類藥物為主，但隨著抗生素的不當(dāng)使用，大腸桿菌耐藥譜和耐藥水平不斷提高，有報道在犢牛上分離的大腸桿菌多重耐藥情況十分嚴(yán)重，導(dǎo)致臨床治療大腸桿菌所致犢牛腹瀉過程中，很多時候抗生素類藥物達不到很好的治療效果[12]。2019年石凱元等[13]在犢牛腹瀉樣品中分離到的大腸桿菌對頭孢哌酮、頭孢唑林、米諾環(huán)素、頭孢曲松4種抗生素敏感；對頭孢呋辛和頭孢他啶2種抗生素中度敏感；對頭孢氨芐、哌拉西林、紅霉素、萬古霉素、強力霉素、青霉素、氨芐西林、羧芐西林、麥迪霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、丁胺卡那霉素、頭孢拉定、慶大霉素、卡那霉素、苯唑西林、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、奧復(fù)酸、四環(huán)素、多西環(huán)素、林可霉素等22種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。本試驗的藥敏試驗結(jié)果與其相比較，發(fā)現(xiàn)引起犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌對頭孢類抗生素普遍敏感，而對青霉素不敏感。

4 結(jié) 論

大理地區(qū)某乳牛場存在BVDV-1b亞型流行。因在犢牛血樣中未測出BVDV，所以，導(dǎo)致該次犢牛嚴(yán)重腹瀉的主要病原為致病性大腸桿菌K99。致病性大腸桿菌K99對頭孢類抗生素普遍敏感，而對青霉素不敏感。